基于定量PCR的使用重复DNA元件作为阴性对照预测用于下一代测序的靶标富集的效率的方法技术

阅读:180 留言:0更新日期:2013-06-06 22:58
本发明专利技术涉及一种基于定量PCR的使用重复DNA元件作为阴性对照预测用于下一代测序的靶标富集的效率的方法。用于测定从DNA文库中的靶标富集的效率的方法包括:将阴性对照序列和阳性对照序列添加至DNA文库,或从文库中挑选阴性对照序列和/或阳性对照序列;测定阴性对照序列的捕获前的量和阳性对照序列的捕获前的量;使用诱饵序列对来自DNA文库的靶标序列进行富集以产生捕获后文库;测定捕获后文库中的阴性对照序列的捕获后的量和阳性对照序列的捕获后的量;并基于阳性对照序列的捕获后的量、阴性对照序列的捕获后的量、阳性对照序列的捕获前的量和阴性对照序列的捕获前的量,测定靶标富集的效率。

【技术实现步骤摘要】
基于定量PCR的使用重复DNA元件作为阴性对照预测用于下一代测序的靶标富集的效率的方法
本专利技术涉及DNA文库组成分析领域,特别是分析DNA文库中的序列的相对丰度变化的方法。
技术介绍
用于对基因组测序的更为有效的技术的需求已导致下一代基因组测序技术的开发。虽然这些下一代测序技术已彻底改革了对基因组测序的方式,这些技术具有其弱点。例如,这些技术不能容易地靶向基因组的特定区域。对基因组的特定区域测序的能力具有许多应用。例如,一些疾病由仅仅少数核苷酸的突变引起。对整个人类基因组测序以鉴定这些少数突变是低效的。类似地,许多复杂疾病涉及单核苷酸多态性(SNP)或与疾病风险关联的SNP组。鉴定基因组中的此种SNP是费力的任务,因为其包括对来自受侵袭个体的基因组DNA的大的区域(典型地,大于100千碱基)测序以查找单个碱基变化或鉴定所有序列变体。为了使该任务便利,已开发了更新的方法,所述方法包括在分析或测序之前针对感兴趣的序列富集文库。富集之后,感兴趣的序列的亚组可被更为有效地测序。富集系统典型地使用含有感兴趣的区域周围的序列的寡核苷酸探针作为诱饵从DNA文库钓取(通过杂交)感兴趣的DNA片段。这些寡核苷酸探针通常包括可促进杂交序列从文库分离的把手。这种富集系统的例子是从AgilentTechnologies,Inc.(SantaClara,CA)可得到的SureSelectTM系统。SureSelectTM系统使用基于生物素-抗生素蛋白的选择技术以富集感兴趣的序列。该系统可显著改进测序工作流程的花费和过程效率。图1显示了图解使用SureSelectTM从文库中富集感兴趣的DNA序列的方法的图。如在图1中所示的,通过将序列片段克隆进连接物(adaptor)中,制备基因组文库样品。接着用生物素标记的RNA诱饵(即,有生物素标签的RNA寡核苷酸)探查该文库。杂交后,使用链霉亲和素-涂覆的磁珠从混合物中分离与生物素标记的诱饵结合的序列。洗涤珠粒(具有结合的序列),然后消化RNA序列以释放作为单链DNA序列的富集的靶标序列。然后可使用PCR扩增感兴趣的DNA序列以产生用于进一步分析或测序的富集的序列。该富集方法允许人们相对容易地关注感兴趣的序列。最近在美国专利申请No.20110184161中公开了类似的方法。根据在该申请中描述的方法,含有片段化的变性的基因组核酸分子的样品在杂交条件下与固定在底物上的寡核苷酸探针接触。然后与固定的探针杂交的感兴趣的核酸分子与其他序列分离,并且结合的DNA片段被从底物中洗脱出来以产生富集的文库。对于此类富集方法,期望的是,在人们做出努力来对富集的文库测序之前,能够证实靶标序列的确被富集(以及富集到什么程度)了。因而,在富集方法中通常包括阳性对照序列和诱饵以容许对富集监测。如果富集的定量估计是期望的,也可包括内标物序列。富集循环后或当富集的估计是期望的时,可从富集的文库中取出一小份并典型地用扩增技术,比如定量PCR(qPCR)进行分析。定量PCR(qPCR)(或实时PCR)可用来扩增并同时定量靶向的DNA分子。所述方法包括扩增DNA样品中的一种或多种特定序列的PCR。同时,在反应混合物中包括探针(典型地,荧光探针)以提供实时定量。用于实时PCR产物的定量的两种常用的荧光探针是:(1)以非序列特异性方式嵌入双链DNA分子的非-序列-特异性荧光染料(例如,Green),和(2)仅在与DNA靶标杂交后或并入PCR产物后容许检测的序列-特异性DNA探针(例如,标记有荧光报告子的寡核苷酸)。荧光报告子的例子可包括具有被另一基团淬灭的一种荧光团的探针。当探针被并入扩增的序列时,荧光团分子或荧光淬灭剂分子被切割,允许荧光团发光。该方法的例子是检验,如在美国专利NO.5,723,591中描述的。检验使用中心探针寡核苷酸侧翼的两条PCR引物。探针寡核苷酸含有荧光团和淬灭剂。PCR方法的聚合步骤期间,聚合酶切割探针寡核苷酸。该切割引起荧光团和淬灭剂被物理上分离,这引起荧光发射变化。因为产生了更多PCR产物,荧光信号的强度增加了。用这些现有技术,人们可以更高的可信度监测DNA文库的富集。但是,仍存在对可用来监测富集过程的方法的需要。
技术实现思路
本专利技术一个方面涉及测定从DNA文库中的靶标富集的效率的方法。根据本专利技术的一种实施方式的方法包括下述步骤:将阴性对照序列和/或阳性对照序列添加至DNA文库,或从DNA文库挑选阴性对照序列和/或阳性对照序列;测定DNA文库中的阴性对照序列的捕获前的量和阳性对照序列的捕获前的量;使用至少一种诱饵序列进行来自DNA文库的靶标序列的富集以产生捕获后文库;测定捕获后文库中的阴性对照序列的捕获后的量和阳性对照序列的捕获后的量;并基于阳性对照序列的捕获后的量与阴性对照序列的捕获后的量的比率,或基于将阳性对照序列的捕获前的量和阴性对照序列的捕获前的量的第一比率(i),与阳性对照序列的捕获后的量和阴性对照序列的捕获后的量的第二比率(ii)进行比较,测定靶标富集的效率。本专利技术的另一方面涉及用于测定从DNA文库中的靶标富集的效率的方法。根据本专利技术的一种实施方式的方法包括下述步骤:将阴性对照序列添加至DNA文库,或从DNA文库中挑选阴性对照序列;测定DNA文库中的阴性对照序列的捕获前的量;使用至少一种诱饵序列,对来自DNA文库的靶标序列进行富集以产生捕获后文库;测定捕获后文库中的阴性对照序列的捕获后的量;通过比较阴性对照序列的捕获前的量与阴性对照序列的捕获后的量,测定靶标富集的效率。本专利技术的其他方面和优势将从下述说明书和所附的权利要求中显而易见。附图简述图1显示了示意性图解使用来自AgilentTechnologies的SureSelectTM系统的靶标富集的方法。图2显示了AluJo的序列以及根据本专利技术的一种实施方式用于AluJo序列的扩增和定量的引物和探针。图3显示了L1MEe的序列以及根据本专利技术的一种实施方式用于L1MEe序列的扩增和定量的引物和探针。图4显示了根据本专利技术的一种实施方式的qPCR检验的标准曲线图。图5显示了根据本专利技术的一种实施方式,捕获实验之前和之后的各种阳性对照序列和SINE阴性对照序列的量。图6A显示了使用各种文库在捕获实验前5种阳性对照序列和一种阴性对照序列(AluJo)的量。图6B显示了据本专利技术的一种实施方式捕获实验后这些序列的量。图7A显示了在各种条件下,捕获实验前5种阳性对照序列和一种阴性对照序列(AluJo)的量。图7B显示了根据本专利技术的一种实施方式,在捕获实验后这些序列的量。图8显示了图解根据本专利技术的一种实施方式的方法的流程图。图9显示了图解根据本专利技术的一种实施方式的方法的流程图。专利技术详述本专利技术的实施方式涉及用于监测来自DNA文库的感兴趣的序列的富集的方法。如上文记录的,在从DNA文库富集感兴趣的序列的方法中,已表明包括阳性对照允许人们监测富集进展。通过使用阴性对照序列,本专利技术的方法提供了富集监测的其他改进。本专利技术的方法可单独使用阴性对照序列或与阳性对照序列组合使用阴性对照序列。本专利技术的实施方式提供了意料不到的益处,特别是当与阳性对照序列一起使用时。此外,本专利技术的方法不是针对具体文库设计的,因而具有一般的可应用性,而不需考虑靶标靶向文库。本文中使用时本文档来自技高网
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基于定量PCR的使用重复DNA元件作为阴性对照预测用于下一代测序的靶标富集的效率的方法

【技术保护点】
用于测定从DNA文库中富集靶标的效率的方法,其包括:将阴性对照序列和/或阳性对照序列添加至DNA文库,或从DNA文库中挑选阴性对照序列和/或阳性对照序列;测定DNA文库中的阴性对照序列的捕获前的量和阳性对照序列的捕获前的量;使用至少一种诱饵序列对来自DNA文库的靶标序列进行富集以产生捕获后文库;测定在所述捕获后文库中的所述阴性对照序列的捕获后的量和所述阳性对照序列的捕获后的量;并基于所述阳性对照序列的捕获后的量与所述阴性对照序列的捕获后的量的比率,或基于将所述阳性对照序列的捕获前的量与所述阴性对照序列的捕获前的量的第一比率(i)与所述阳性对照序列的捕获后的量与所述阴性对照序列的捕获后的量的第二比率(ii)进行比较测定所述靶标富集的效率。

【技术特征摘要】
2011.11.30 US 13/308,4821.用于测定从DNA文库中富集靶标的效率的方法,其包括:将阴性对照序列添加至DNA文库或从DNA文库中挑选阴性对照序列,且将阳性对照序列添加至DNA文库或从DNA文库中挑选阳性对照序列;测定DNA文库中的阴性对照序列的捕获前的量和阳性对照序列的捕获前的量;使用至少一种诱饵序列对来自DNA文库的靶标序列进行富集以产生捕获后文库;测定在所述捕获后文库中的所述阴性对照序列的捕获后的量和所述阳性对照序列的捕获后的量;并基于所述阳性对照序列的捕获后的量与所述阴性对照序列的捕获后的量的比率,或基于将所述阳性对照序列的捕获前的量与所述阴性对照序列的捕获前的量的第一比率(i)与所述阳性对照序列的捕获后的量与所述阴性对照序列的捕获后的量的第二比率(ii)进行比较测定所述靶标富集的效率,其中所述阴性对照序列是选自长散布元件(LINE)或短散布元件(SINE)的重复元件,所述阳性对照序列是在DNA文库中找到的那些或掺入DNA文库的外源序列。2.根据权利要求1的方法,其中所述重复元件是Alu元件。3.根据权利要求2的方法,其中所述重复元件是AluJo,AluJo的序列为SEQIDNO:1。4.根据权利要求1的方法,其中所述重复元件是L1MEe,L...

【专利技术属性】
技术研发人员:斯科特·哈珀约瑟夫·晃·海·翁
申请(专利权)人:安捷伦科技有限公司
类型:发明
编号:201210439584
国别省市:

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