本发明专利技术提供了一种可诱导慢病毒miRNA表达载体，包含慢病毒转移结构的基因HIV-1RNA包装信号、5’LTR和3’LTR以及四环素反应元件(TRE)和EF-1α启动子。该系统提供了一个能够指导在哺乳动物细胞内合成miRNA的表达载体。载体使用的四环素反应元件(TRE)和EF-1α基因启动子确保该载体在哺乳动物细胞中的高水平表达。载体在无强力霉素(DOX)存在条件下，目的miRNA的表达受抑制，而有Dox存在时，则其被诱导表达。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物技术及医学领域,具体涉及可诱导慢病毒miRNA表达载体及其构建方法。
技术介绍
miRNAs是一种能够调节基因表达长度为21_25个核苷酸的非编码RNA链，具有控制细胞增殖、分化、凋亡、肿瘤形成和药物敏感性等多种细胞功能。众所周知，miRNAs经历过基因扩增、基因删除和表观遗传沉默等基因突变,这些基因突变最终能激活或者灭活疾病基因。在人类多种疾病中，某些miRNAs始终是失调的。这些失调的miRNAs并不局限于特定的疾病类型，而且异常表的miRNAs与临床病情,如肿瘤分期、药物敏感性和病人生存率等相关。此外，最近有研究表明miRNAs有助于细胞转化、肿瘤形成和〒细胞维护。最后，miRNAs功能学研究直接观察到特异性miRNAs在体内或者体外具有强大的抗癌活性或致癌活性。由于异常表达的miRNAs在人类疾病的发展中起着关键作用，通过拮抗或者恢复miRNAs的功能来纠正miRNAs的失调和缺陷将会给临床疾病治疗带来巨大的进步。基于miRNA的治疗策略已经成为了一个极具潜力的治疗方法。为了使miRNAs成为有效的治疗方法，它们应该被系统性调控，通过特异且高效的转移系统运送到特定组织,然后被靶细胞摄入胞浆。在胞浆中，它们以完整的形式被细胞使用。miRNAs在哺乳动物细胞系用于短期基因抑制是非常有效的，但是用于转录水平长期稳定的敲除靶基因是有困难的。与其它核苷酸结构类似，miRNAs在临床应用....t存在稳定性和转移问题。miRNAs与siRNAs —样，细胞膜穿透能力差、体内稳定性有限和细胞内转移依赖于系统调控。为了使miRNAs从一种实验手段转变成可使病人受益的临床治疗方法,我们需要一种特异性强且有效的基因转移表达系统。由于慢病毒，如人类免疫缺陷病毒I，能转染分裂细胞或者非分裂细胞并将其DNA整合到宿主细胞基因组中，因 而是一种miRNAs治疗的有效运载工具。慢病毒载体通常是通过几种不同的质粒共转染293T人胚胎肾细胞获得的。第一个临床慢病毒载体产物来自双质粒系统。为了进^-步改进该系统的生物安全性,慢病毒基因组被分成了 4个质粒。这些质粒分别是:自我失活的转移质粒、编码gag-pol蛋白包装质粒、rev质粒和一个可以编码水泡型口炎病毒G蛋白(VSV-G)的包膜糖蛋白质粒。慢病毒载体是将目的基因或者基因沉默序列稳定转移到细胞的最为有效的运载工具。基因转移伴有假构型慢病毒包膜蛋白与靶细胞膜结合和融合。然后,含有miRNAs基因或者基因沉默序列的慢病毒基因组RNA被逆转录成DNA，并以极高的效率与细胞的基因组永久整合。最后，miRNAs基因或者基因沉默序列在细胞内表达，产生细胞在基因水平上永久性改变的预期效果。严格控制单基因如特异性miRNAs的表达系统将极大的有助于复杂基因环境条件下如哺乳动物细胞miRNAs功能的研究。理想情况下,这样一个系统不仅可以介导miRNAs表达活性的“开关”状态，还可以介导在设定阈值水平F允许其有限的表达。
技术实现思路
本专利技术的任务是提供。实现本专利技术的技术方案是:本专利技术提供的这种可诱导慢病毒miRNA表达载体,包含慢病毒转移结构的基因HIV-1RNA包装信号、5’ LTR和3’ LTR以及四环素反应元件(TRE)和EF-1 a启动子,见图1。本专利技术方案提供的生产细胞可以是293T肾上皮细胞系、CHO中国仓鼠卵巢细胞、COS非洲猴肾细胞系、HepG2人肝癌细胞系、BHK叙利亚仓鼠肾细胞系、Sf9昆虫卵巢细胞系、Sf21昆虫卵巢细胞系、293人胚肾脏细胞、ffiK 293人胚肾细胞系、SODkO、NIH-3T3鼠成纤维细胞系、Vero非洲绿猴肾细胞或PerC6人胚肾脏细胞。本专利技术可诱导表达的基因是miRNA的RNAs。本专利技术使用的慢病毒基因表达载体是第三代慢病毒基因转移表达载体，即将整个慢病毒基因组分成四个质粒:自我失活的转移质粒、编码gag-pol蛋白包装旗粒、rev旗粒和Iv可以编码水泡型口炎病毒G蛋白(VSV-G)的包U旲糖蛋白旗粒，miRNA的表达具有稳定和可遗传性,诱导慢病毒tniRNA表达载体常用于构建动物模型,如转基因鼠。本专利技术提供的可诱导慢病毒miRNA表达载体构建方法包括以下步骤:(I)构建pCR2.1-EF- a克隆载体和pCR2.1-TRE克隆载体，具体步骤是:①根据载体pT·RE2hyg (BD Life Science)序列(见图 2),设计TRE序列的PCR引物，上游引物为5’ -ACCGGTAGACGCTGTCGAA-3 ’，含有Agel酶切位点；下游引物5’ -ACGCGTAGCAACCAGGTGT-3’，含有 Mlul 酶切位点；②Clal酶切割pTRE2hyg载体(见图3)，用步骤I所述引物PCR扩增TRE序列；(见图4，5)③采用克隆TA cloning试剂盒,用T4连接酶将PCR产物TRE序列与线性化的PCR2.1载体连接；(见图6.7)④将步骤3所得到产物pCR2.1-TRE载体转化感受态大肠杆菌DII51,筛选阳性克隆;⑤扩增质粒,酶切鉴定；⑥酶切鉴定正确后,送公司测序；⑦根据pEP-miR 载体(Cell Biolabs, Inc)序列(见图.8)，设计 EF-a启动子PCR引物，上游5，-ACGCGTGATGCCTCCCCG-3’，含有Mlul酶切位点；下游5’-GTCGACACCCGTTGCGAAA-3’，含有seal I酶切位点,然后用PCR扩增EF-a启动子序列,按上述步骤3-6,获得pCR2.1-EF-1 a载体。(见图9_13)(2)构建 pLK0.1-TRE-EF- a -MCS-puTo 表达载体，具体步骤是:①将双酶切法将TRE与EF- a序列从所构建的pCR2.1-TRE载体和pCR2.1-EF- a载体切下来；(图14,15)②用Agel和Mlul两个酶切位点切切割pLK0.1-puro (见图16)，并将TRE序列与pLK0.l puro 连接，得到 pLK0.1-TRE-puro ;(见图 17)；③将步骤2得到的pLK0.1 -TRE-MCS-puro,经Mlul和Sal酶切，并与扩增EF- a启动子序列连接，得到 pLK0.1-TRE-EF- a -MCS-puro ;(图.18)④将步骤3所得产物pLK0.1-TRE-EF- a -puro转化感受态大肠杆菌DH51,双酶切鉴定; ⑤扩增质粒,酶切鉴定；⑥送公司测序。(3)构建EGFP表达载体，具体步骤是:①根据pEGFP-NI 载体(BD Life Science)(见图 19)，设计 EGFP序列引物,5，-GTCGACGCAGGGCAATAATGAT-3，,含有Scall酶切位点；下游5’ CTCGAGCGGCGGGTCTTGTAGT-3’，含有酶切位点 Xho I ；②PCR扩增EGFP序列；(见图20)③将步骤2所得到得EG FP序列(图21),经双酶切后，与pLK0.1连接；(见图.22)④将步骤3所得到产物pCR2.1-TRE载体转化感受态大肠杆菌DH51,筛选阳性克隆;⑤扩增质粒,酶切鉴定；⑥送公司测序。以慢病毒为基础的基因治疗代表着最新一代强大的、多用途载体,可以将不同的基因转移入几乎所有的哺乳动物细胞，包括本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种可诱导慢病毒miRNA表达载体，其特征在于：该载体包含慢病毒转移结构的基因HIV?1RNA包装信号、5’LTR和3’LTR以及四环素反应元件(TRE)和EF?1α启动子。
【技术特征摘要】
1.一种可诱导慢病毒miRMA表达载体,其特征在于:该载体包含慢病毒转移结构的基因HIV-1RNA包装信号、5’ LTR和3’ LTR以及四环素反应元件(TRE)和EF-1 α启动子。2.根据权利要求1所述的可诱导慢病毒miRNA表达载体构建方法,其特征在于:生产细胞是293T肾上皮细胞系、CIIO中国仓鼠卵巢细胞、COS非洲猴肾细胞系、HepG2人肝癌细胞系、BHK叙利亚仓鼠肾细胞系、Sf9昆虫卵巢细胞系、Sf21昆虫卵巢细胞系、293人胚肾脏细胞、HEK 293人胚肾细胞系、SODkO、NIH-3T3鼠成纤维细胞系、Vero非洲绿猴肾细胞或PerC6人胚肾脏细胞。3.根据权利要求1所述的可诱导慢病毒miRNA表达载体构建方法,其特征在于:可诱导表达的基因是miRNA的RNAs。4.根据权利要求1所述的可诱导慢病毒miRNA表达载体构建方法,其特征在于:慢病毒基因表达载体是第三代慢病毒基因转移表达载体即将整个慢病毒基因组分成四个质粒:自我失活的转移质粒、 编码gag-pol蛋白包装质粒、rev质粒和一个可以编码水泡型口炎病毒G蛋曰(VSV-G)的包 膜糖蛋曰)贞粒。5.根据权利要求1所述的可诱导慢病毒miRNA表达载体构建方法,其特征在于:miRNA的表达具有稳定和可遗传性，诱导慢病毒miRNA表达载体常用于构建动物模型，如转基因鼠。6.根据权利要求1所述的可诱导慢病毒miRNA表达载体构建方法如下: (1)构建PCR2.1-EF- α克隆载体和pCR2.1-TRE克隆载体,具体步包括: ①根据载体pTRE2hyg(BDLife Science)序列，设计TRE序列的PCR引物，上游引物为5’ -ACCGGTAGACGCTGTCGAA-3’，含有Agel酶切位点；下游引物·5’ -ACGCGTAGCAACCAGGTGT-3’，含有 Mlu:丨.酶切位点； ②Clal酶切割pTRE2hyg载体,用步骤I所述引物PCR扩增TRE序列； ③采用克隆TAcloning试剂盒，用T4连接酶将PCR产物TRE序列与线性化的pC...
【专利技术属性】
技术研发人员：杨操，杨述华，刘映乐，葛挺，刘先哲，李帅，赵伯明，
申请(专利权)人：华中科技大学同济医学院附属协和医院，
类型：发明
国别省市：
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