低密度脂蛋白胆固醇定量法制造技术

技术编号:8621326 阅读:218 留言:0更新日期:2013-04-25 02:54
本发明专利技术公开一种低密度脂蛋白胆固醇定量法,采用优化浓度和比例的聚乙烯硫酸三钾(polyvinylsulphate?K-salt,PVS)和聚乙二醇独甲醚(Methoxypolyethylene?glycol,PEGME),即优化的化学沉淀法,联合对低密度脂蛋白胆固醇反应性较好的表面活性剂进行特异性的低密度脂蛋白胆固醇的含量测定。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及对低密度脂蛋白胆固醇的改良的测定方法及相关试剂盒。
技术介绍
血浆中胆固醇的存在和运输形式为血浆脂蛋白,即血浆中非极性的脂类包括胆固醇和亲水性的载脂蛋白结合,使得脂蛋白有较强的水溶性可以在血中运输。血浆脂蛋白可以分为高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、极低密度脂蛋白和乳糜颗粒四种,其中低密度脂蛋白主要负责将胆固醇运输至外周组织,而高密度脂蛋白是清除动脉壁上的胆固醇向肝脏运输。流行病学和临床研究表明,低密度脂蛋白胆固醇水平与动脉硬化类疾病冠心病的发生率成正相关,高密度脂蛋白胆固醇与动脉硬化类疾病冠心病的发生率成负相关,即具有抗动脉硬化活性。因此高密度脂蛋白胆固醇HDL-C、低密度脂蛋白胆固醇LDL-C是当前临床实验室血脂测定中最有价值的心脑血管疾病的危险因素指标。 测定高低密度脂蛋白胆固醇的方法很多,包括超离心法、色谱法、电泳法和沉淀法等。超离心法可作为基本的定量法使用,它使用超速离心机进行分离,根据比重的差别分离LDL或HDL,进而测定其中的胆固醇含量;而后来发展的电泳法以醋酸纤维膜或琼脂糖凝胶等做载体分离,然后根据酶法测定胆固醇含量;在沉淀法中,沉淀剂凝结除高密度脂蛋白以外的脂蛋白,凝结的脂蛋白通过离心分离沉淀,根据酶反应测定上清即高密度脂蛋白胆固醇的含量;测定低密度脂蛋白胆固醇的第一代化学沉淀法,采用PVS和PEGME沉淀LDL,用离心分离法收集沉淀物,然后根据酶反应测定其中的胆固醇含量;以上方法均需要特殊仪器,包括超速离心机、电泳仪和离心机等,操作复杂,难于自动化,从而无法在临床实验室开展。
技术实现思路
本方法所涉及的直接定量低密度脂蛋白胆固醇的方法,采用优化的PVS沉淀法,仅包裹LDL使其无法参与酶反应,但不会沉淀LDL即形成不溶物,然后LDL中的胆固醇成分在第一和第二表面活性剂的联合作用下直接测量;详细而言,即高密度脂蛋白、极低密度脂蛋白和乳糜微粒中的胆固醇在对低密度脂蛋白以外的脂蛋白胆固醇反应性较好的第一表面活性剂的作用下参与胆固醇脂酶反应,低密度脂蛋白胆固醇在第二表面活性剂的作用下溶解释放以进行酶反应法测定其胆固醇含量。酶反应中第一步产生的过氧化氢不必使用过氧化物酶去除,所以在第二步中不必加入抑制过氧化物酶活性的叠氮钠。本专利技术中可以使用生物防腐剂。本专利技术的方法中无需标本前处理即沉淀和离心,可以直接在自动生化仪测定标本中的低密度脂蛋白胆固醇。本专利技术所用的优化的聚乙烯硫酸三钾PVS化学沉淀法即优化浓度和比例的PVS和PEGME,在检测低密度脂蛋白胆固醇时,采用优化浓度和比例的PVS和PEGME包裹LDL,优化后的比例为1:400-500,浓度分别为l-20mg / L和4g_10g / L ;同时为了避免VLDL的共同被包裹,采用能掩蔽二价阳离子的金属螯合剂包括EDTA或EGTA等,其使用浓度为O.lmM-2mM ;其他只要是和低密度脂蛋白亲和性较强的化合物,可以是促使其凝聚的聚阴离子、肝素钠、磷钨酸、环糊精硫酸盐等,或对其有较强亲和力又不导致沉淀产生的皂苷类化合物也可以使用,它们可以单独使用或两种或以上组合使用,这些物质的使用量不受特别限制,根据物质种类及组合方式而不同,尽量选用凝结或混浊少的组合;同时为了生化仪的维护要求,尽量不使用或使用低浓度的镁离子。对于第一表面活性剂的选用,可以是离子或非离子的选择性表面活性剂,可以是对高密度脂蛋白有较好反应性的表面活性剂或对低密度脂蛋白以外的脂蛋白有较好反应性的表面活性剂,如聚氧乙烯类衍生物或聚氧乙烯-聚氧丙烯的缩合物,包括聚氧乙烯高级醇醚、聚氧乙烯月桂基醚、聚氧乙烯十六烷基醚、聚氧乙烯油基醚、聚氧乙烯烷基醚、聚氧乙烯烷基苯基醚、聚氧乙烯亚烷基苯基醚、聚氧乙烯亚烷基三苯基醚或聚氧乙烯烷基醚硫酸盐等。对于第二表面活性剂的选用,其是可以与所有脂蛋白反应或至少可以与低密度脂蛋白反应的表面活性剂,如 L121,或 Triton X100、Tween 20、lipomin LA、Anhitol 24B 和胆酸等。作为这些表面活性剂的商业上可得到的产品实例,包括Emulgen系列如Emulgen108、Emulgen220、Emulgen 913、Emulgen709、Emulgen B66、Emulgen A60 (或 A6 系列)、Emulgen A90 (或 A9 系列)、Emulgen 911、Emulgen L-40 等,和 pluronic 系列如 PluronicF88> PluronicF68> Pluronic L121、Pluronic L123、Pluronic L101> Pluronic L108 等和Triton XlOO等。这些表面活性剂可以单独使用或者两种或以上组合使用。这些表面活性剂的用量没有特别限制,一般来说,表面活性剂的浓度优选为O. 01% — 3% w / V之间。特别优选的浓度为O. 05%-l%w / V。胆固醇反应应用胆固醇酯酶和胆固醇氧化酶进行,生成的过氧化氢在过氧化物酶作用下用4-氨基安替比林和高敏感度色原进行吸光度分析测定,并计算出低密度脂蛋白胆固醇的含量。作为商业上可得到的色原包括日本同仁化学的N-乙基-N- (2-羟基-3-磺丙基)-间苯甲胺(T00S )、N- (2-羟基-3-磺丙基)-3,5- 二甲氧基苯胺(HDAOS )、N-乙基-N- (3-甲基苯基)-N’ -琥珀酰基乙二胺(EMSE)等。作为这些色原的浓度,优选O.1mM-lOmM。用于低密度脂蛋白胆固醇定量的试剂,除含有以上所属化合物、表面活性剂、酶及色原等外,其所采用的缓冲液为Goods缓冲液,例如有HEPES、MES、MOPS和PIPES等。缓冲液的PH为5-10,优选为6-8。缓冲液的浓度为5-200mM,优选为20mM-100mM。附图说明图1显示采用本专利技术的检测低密度脂蛋白胆固醇的试剂盒I检测结果与对照试剂的检测结果具有相关性;图2显示采用本专利技术的检测低密度脂蛋白胆固醇的试剂盒2检测结果与对照试剂的检测结果具有相关性。 具体实施方式实施例1用于检测低密度脂蛋白胆固醇的试剂盒I的成分和使用方法1.试剂成分本申请的检测低密度脂蛋白胆固醇的试剂盒I包括两种成分,分别是试剂IMOPS (pH7.0)20mMPVS20rng/LPEGME8g/LEDTA2 mM4AA0.5g/L 胆固醇酯酶5KU/L胆固醇氧化酶10KU/LEmulgen A6 糸列O.1 %w/vPC3000.5g/L试剂2MOPS (pH7.0)20mM过氧化物酶30KU/LHDAOS2mMTriton X IOOlg/LPC3000.5g/L2.试剂盒I的使用方法使用Olympus AU400自动分析仪分别进行测定,实验操作如下血清3口 I,第一试剂225 μ 1,37°C反应5分钟,第二试剂75 μ I反应5分钟,测定主波长600nm,副波长700nm,用吸光度差进行计算。对照试剂按照其说明书所述参数进行实验。方法对比中,本试剂和对比试剂(日本协和Kyowa Medex Co.,下同)分别用各自的校准血清进行定标。同时测定了 40例临床标本LDL-C含量,结果如表1、图1所示。结果显示出检测低密度脂蛋白胆固醇的试剂盒I按本专利技术方法获本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种测定样品中低密度脂蛋白胆固醇的含量的方法,其步骤为:1)用优化比例和浓度的聚乙烯硫酸三钾和聚乙二醇独甲醚与所述的样品接触,所述的聚乙烯硫酸三钾和聚乙二醇独甲醚的优化比例为1:400?500,所述的优化浓度分别为10?20mg/L和4g?10g/L;2)在不形成沉淀的条件下联合至少一种表面活性剂通过酶法测定所述样品中低密度脂蛋白胆固醇的含量。

【技术特征摘要】
2008.04.01 CN 200810103234.31.一种测定样品中低密度脂蛋白胆固醇的含量的方法,其步骤为 1)用优化比例和浓度的聚乙烯硫酸三钾和聚乙二醇独甲醚与所述的样品接触,所述的聚乙烯硫酸三钾和聚乙二醇独甲醚的优化比例为1:400-500,所述的优化浓度分别为10-20mg / L 和 4g-10g / L ; 2)在不形成沉淀的条件下联合至少一种表面活性剂通过酶法测定所述样品中低密度脂蛋白胆固醇的含量。2.根据权利要求1所述的方法,其中所述的至少一种表面活性剂为第一表面活性剂和第二表面活性剂的组合,所述第一表面活性剂选自聚氧乙烯高级醇醚、聚氧乙烯月桂基醚、聚氧乙烯十六烷基醚、聚氧乙烯油基醚、聚氧乙烯烷基醚、聚氧乙烯烷基苯基醚、聚氧乙烯亚烷基苯基醚、聚氧乙烯亚烷基三苯基醚或聚氧乙烯烷基醚硫酸盐;所述第二表面活性剂选自 Triton X100、聚氧乙烯-聚氧丙烯的缩合物Pluronic L121、Pluronic L123、PluronicL101> Pluronic L108、PluronicF68、Tween 20、lipomin LA、Anhitol 24B 或胆酸。3.根据权利要求2所述的方法,进一步加入O.lmM-2mM的能掩蔽二价阳离子的金属螯合剂...

【专利技术属性】
技术研发人员:孙国敬
申请(专利权)人:北京九强生物技术股份有限公司
类型:发明
国别省市:

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