本发明专利技术涉及一种重组人粒细胞刺激因子的纯化方法，该方法包括以下步骤：a、选用工程菌做菌株进行发酵培养；b、对发酵培养所得菌体进行包涵体的分离和洗涤，得到精制包涵体；c、对精制包涵体进行复性，得到复性产物；d、对复性产物进行阴离子柱层析处理，得到阴离子柱层析产物；e、对阴离子柱层析产物进行阳离子柱层析，得到阳离子柱层析产物；f、对阳离子柱层析产物进行精细分离，采用反相填料柱层析处理，得到重组人粒细胞集落刺激因子。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物
，特别涉及。本专利技术在纯化工艺中采用了反相填料的精细分离纯化步骤。同现有技术相比较，可以大幅度地提高重组人粒细胞刺激因子的纯度、比活及稳定性。
技术介绍
重组人粒细胞集落刺激因子(rhG-CSF)是特异作用于粒系祖细胞、促进其向成熟中性粒细胞增殖、分化的造血生长因子。具有以下功能1.促进骨髓移植后中性粒细胞计数增加。 2.癌症化疗引起的中性粒细胞减少。3.骨髓异常增生综合症伴发的中性粒细胞减少症。4.再生障碍性贫血伴发的中性粒细胞减少症。5.先天性、特发性中性粒细胞减少症。重组人粒细胞集落刺激因子已经可以通过基因重组生物工程技术进行量产。但其纯化工艺经过多年研究始终难以解决其纯度问题，且比活下降明显，如现有技术“粒细胞集落刺激因子(G-CSF)在大肠杆菌中的高效表达及快速纯化工艺的建立”中国生物化学与分子生物学报《 1998，Vol. 14描述了以下技术方案稀释复性蛋白，之后一步S P — S epharoseF F柱层析至均质.纯化的G —C S F蛋白比活性达3. 4X 108U/mg，每升表达菌液回收的G —C S F总活性达1.06X10nU/mgU.纯化产物的N—端氨基酸序列分析表明，对甲硫氨酸的去除彻底，用于人体时可能具有较小的免疫原性和毒性。重组人粒细胞集落刺激因子的纯化《微生物学免疫学进展》1998年02期描述了以下技术方案包涵体变性复性后，r h G — C S F的活性得到恢复。用离子交换和疏水层析纯化了 r h G — C S F，比活性达1. 57X 108U/mg，纯度大于9 8%。本专利技术经过对不同纯化工艺的研究，筛选出一种纯化方法，其技术方案是在纯化工艺中采用了反相填料的精细分离纯化步骤。包括步骤a、选用工程菌做菌株进行发酵培养；b、对发酵培养所得菌体进行包涵体的分离和洗涤，得到精制包涵体；c、对精制包涵体进行复性，得到复性产物；d、对复性产物进行阴离子柱层析处理，得到阴离子柱层析产物；e、对阴离子柱层析产物进行阳离子柱层析，得到阳离子柱层析产物；f、对阳离子柱层析产物进行精细分离，采用反相填料柱层析处理，得到重组人粒细胞集落刺激因子。同现有技术相比较，采用本专利的反相填料精细分离，rhG-CSF电泳纯度由90%提高到99 %，HPLC纯度由90 %提高到99 %，其比活由O. 8 X 107U/mg提高到3 X 108U/mg。可见，采用本专利技术的重组人粒细胞集落刺激因子的纯化工艺，可以大幅度的提高rhG-CSF的纯度、比活，以及稳定性。
技术实现思路
本专利技术提供一种rhG-CSF的纯化方法，该方法包括以下步骤a、选用工程菌做菌株进行发酵培养；b、对发酵培养所得菌体进行包涵体的分离和洗涤，得到精制包涵体；C、对精制包涵体进行复性，得到复性产物；d、对复性产物进行阴离子柱层析处理，得到阴离子柱层析产物；e、对阴离子柱层析产物进行阳离子柱层析，得到阳离子柱层析产物；f、对阳离子柱层析产物进行精细分离，采用反相填料柱层析处理，得到重组人粒细胞集落刺激因子。 其中步骤a_c属于现有技术，可以根据现有技术中的方法获得。本专利技术所述的步骤d_f属于纯化步骤，属于本专利技术的技术方案，其中，优选的技术方案如下阴离子柱层析(XK50/30层析柱，Q sepharose FF填料)使用平衡液(20mmol/L pH8. 2 Tris-HCl缓冲液)，调节泵流速为30. 0-49. 9ml/min。平衡8_10倍柱床体积。样品预处理将复性产物用2mol/L pH8. 2 Tris-HCl调其pH值为8. 2，然后超滤浓缩至复性体积的1/10，即为上样液。上样上样时泵流速为8. 0-49. 9ml/min。上样结束后用平衡液平衡2_4个柱床体积。洗脱使用预洗液(20mmol/L pH7. 8 NaH2PO4-Na2HPO4缓冲液)进行预洗，调节泵流速为30. 0-49. 9ml/min，洗脱2_4个柱床体积。然后将进液管换至洗脱液(20mmol/L pH7. 8NaH2P04-Na2HP04缓冲液、O.1MNaCL)中，开始目标峰洗脱，收集OD28tl大于O. 3洗脱峰。阳离子柱层析(XK50/30层析柱，CM Sepharose FF填料)平衡使用平衡液(20mmol/L pH4. 5 HAc-NaAc缓冲液)，调节泵流速为30. 0-49. 9ml/min，平衡8-10倍柱床体积。上样上样液为上步得到的OD28tl大于O. 3的洗脱液，调节泵流速为30. 0-49. 9ml/min,开始上样。上样结束后，换至平衡液中，平衡2-4个柱床体积，至记录笔回至基线。用预洗液(20mmol/L pH4. 5HAc_NaAc缓冲液、O. 15 MNaCL)进行预洗，调节泵流速为30. 0-49. 9ml/min,至杂质峰洗下为止。换至洗脱液(50mmol/LpH4. 5HAc-NaAc缓冲液、O. 2MNaCL进行洗脱目的峰，收集OD28tl大于O. 3的洗脱峰。反相填料层析采用Pharmacia 公司的预装型 SOURCE 5RPC 4. 6/150 柱(粒径 5 μ m，4. 6 X 150mm、柱温度2-6°C，流速l.Oml/min)。配制洗脱液A为含IOOmmolNaCl溶液IOmmol pH= 8.0Tris-HCl 缓冲液，洗脱液 B 为含 IOOmmolNaCl、50% 乙腈的 IOmmol pH= 8.0 Tris-HCl 缓冲液。先用洗脱液A洗脱；再用梯度20%-80%洗脱液B洗脱，15-35分钟收集样品峰。被收集的样品经低温蒸发，除去有机物质，然后透析浓缩后保存在2-8°C条件下。rhG-CSF经阳离子交换层析分离纯化样品经SDS-PAGE电泳后，用凝胶成像扫描系统分析，其电泳纯度为90 %，HPLC纯度为90 %，其比活能达到O. 8 X 107U/mg，在2_8°C条件下放置该样品3个月其电泳纯度和活性均无显著性变化。放置6个月其纯度和比活降低。可确定稳定性可以保证3个月。rhG-CSF经反相填料层析分离纯化样品经取样检测，其电泳纯度与HPLC纯度均大于99%，经测定其比活可达到3.0X108U/mg。该样品在4°C条件下放置12个月，该样品电泳纯度和活性均无显著性变化。稳定性可以保证12个月。其他质量控制项目均符合药典要求。采用本专利技术的重组人粒细胞集落刺激因子的纯化工艺，可以大幅度地提高rhG-CSF的纯度、比活、稳定性。本专利技术的工艺方法是经过筛选获得的，筛选过程如下层析方式的选择针对现有技术设计了 5种层析方式，用这5种方式对复性溶液进行纯化，然后进行测定，实验结果如下本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种rhG?CSF的纯化方法，该方法包括以下步骤：a、选用工程菌做菌株进行发酵培养；b、对发酵培养所得菌体进行包涵体的分离和洗涤，得到精制包涵体；c、对精制包涵体进行复性，得到复性产物；d、对复性产物进行阴离子柱层析处理，得到阴离子柱层析产物；e、对阴离子柱层析产物进行阳离子柱层析，得到阳离子柱层析产物；f、对阳离子柱层析产物进行精细分离，采用反相填料柱层析处理，得到重组人粒细胞集落刺激因子。
【技术特征摘要】
1.一种rhG-CSF的纯化方法，该方法包括以下步骤a、选用工程菌做菌株进行发酵培养；b、对发酵培养所得菌体进行包涵体的分离和洗涤，得到精制包涵体；C、对精制包涵体进行复性，得到复性产物；d、对复性产物进行阴离子柱层析处理，得到阴离子柱层析产物；e、对阴离子柱层析产物进行阳离子柱层析，得到阳离子柱层析产物；f、对阳离子柱层析产物进行精细分离，采用反相填料柱层析处理，得到重组人粒细胞集落刺激因子。2.根据权利要求1的纯化方法，其特征在于，所述对复性产物进行阴离子柱层析处理方法如下阴离子柱层析(XK50/30层析柱，Q sepharose FF填料)使用平衡液(20mmol/L pH8. 2 Tris-HCl缓冲液)，调节泵流速为30. 0-49. 9ml/min，平衡8-10倍柱床体积，样品预处理将复性产物用2mol/L pH8. 2 Tris-HCl调其pH值为8. 2，然后超滤浓缩至复性体积的1/10，即为上样液，上样上样时泵流速为8. 0-49. 9ml/min，上样结束后用平衡液平衡2_4个柱床体积，洗脱使用预洗液(20mmol/L pH7. 8 NaH2PO4-Na2HPO4缓冲液)进行预洗，调节泵流速为30.0-49.91111/1^11，洗脱2-4个柱床体积，然后将进液管换至洗脱液(20臟01/1 pH7. 8 NaH2P04-Na2HP04缓冲液、O.1MNaCL)中，开始目标峰洗脱，收集OD28tl大于O. 3洗脱峰。3.根据权利要求1的纯化方法，其特征在于，所述对阴离子柱层析产物进行阳离子柱层析，方法如下阳离子柱层析(X...
【专利技术属性】
技术研发人员：王伟权，陆刚，陈玉军，庞睿，李邦东，牛国玲，于俊清，杨凤铎，陶永宝，赵海丹，宋成君，
申请(专利权)人：哈药集团生物工程有限公司，
类型：发明
国别省市：
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