本发明专利技术涉及一种在双峰驼褪黑素受体、编码基因及其获取方法，本发明专利技术中的双峰驼褪黑素受体基因的cDNA序列是通过以双峰驼组织中总RNA为模板，参考人、鼠、牛等物种的褪黑素受体基因的同源序列设计引物，进行反转录PCR而获得的新基因序列。获得的双峰驼褪黑素受体基因cDNA序列见SEQ?ID?NO.1。将双峰驼褪黑素受体基因cDNA序列中的编码序列(CDS)按通用密码子翻译成的蛋白质编码序列见SEQ?ID?NO.2。本发明专利技术通过对包括SEQ?ID?NO.1在内的8个物种的八条褪黑素受体基因的CDS序列构建了系统发生树，结果发现：双峰驼褪黑素受体同褐家鼠的进化距离最近，间接证明了所得到的序列确为双峰驼褪黑素受体基因。
【技术实现步骤摘要】
所属
本专利技术属于基因工程
，特别是涉及一种在。
技术介绍
褪黑素(melatonin，MT)是由动物脑部的松果体细胞在暗环境下所分泌的吲哚类激素，其化学名称为N-乙酰-5-甲氧基色胺。它的生理功能是由褪黑素受体(melatonin acceptor,MTR)介导的，松果体是生物钟的重要组成部分，通过分泌褪黑素的节律性改变来影响许多组织、腺体的代谢功能。因此，研究褪黑素及其受体作用机制、作用靶器官等对于揭示、提高和调控动物许多生理机能具有重要的基础研究价值。研究发现，MTR是一种具有多种生物学功能的蛋白质并与医学有着重要的关系。主要存在于肠组织上。MTR与MT特异性结合，通过信号转导系统产生生物学效应。MT可影响哺乳动物次级毛囊和毛绒生长，能够刺激体外培养的哺乳动物次级毛囊纤维生长，可调节生殖系统发育和功能，同时可以诱导皮毛提如成熟，提闻毛续广量。褪黑素受体的研究，在2008年，李子海等人研究了褪黑素对毛发生长的影响就， 表明不同浓度的褪黑素对毛发生长和毛发颜色的影响不同。2011年，陈建波等人就褪黑素受体对绒山羊绒毛生长的影响及其作用机理作了研究，结果表明褪黑激素对绒山羊绒毛生长具有促进作用，褪黑激素是通过影响类胰岛素生长因子或催乳素的分泌间接影响绒毛生长；是通过调控皮肤组织中脱碘酶基因表达或者改变皮肤中催乳素受体基因可变剪接规律影响绒毛生长。在双峰驼中，褪黑素受体具有广泛的生物学功能，尤其对动物毛发生长周期、换毛等其它生物节律和免疫活动等都具有重要的调节作用。因此，对骆驼褪黑素受体的研究将有助于细胞生物学和医学的发展。
技术实现思路
一种双峰驼褪黑素受体，其氨基酸序列如下述(a)或(b)所示 (a) SEQ ID NO. 2 所示序列；(b)在(a)限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或/和叠加一个或多个氨基酸衍生得到的，且与(a)编码蛋白质具有相同功能的保守性变异多肽、活性片段或活性衍生物的氨基酸序列。一种双峰驼褪黑素受体编码基因，该序列是与毛囊发育和毛色形成密切相关的基因，其核苷酸序列如下述(a)或(b)所示(a) SEQ ID NO.1 所示序列；(b)由碱基简并或/和替代衍生的与(a)所述核苷酸序列90%以上同源性，且与 (a)编码相同功能蛋白质的序列。本专利技术还提供了一种双峰驼褪黑素受体基因的克隆和测序方法，该方法包括步骤(I)组织分离(Isolation) ； (2)总 RNA 的分离(Total RNA isolation)包括①提取 RNA 的准备工作组织总RNA提取组织总RNA的鉴定。(3)全长cDNA的克隆(Cloning of Full-length cDNA)包括①引物设计及合成RT-PCR扩增；③克隆和测序，其特征在于 PCR引物的正向引物为SEQ ID NO. 3和反向引物为SEQ ID NO. 4，其序列信息如下SEQ ID NO. 3 :5’ -ATGTGGGAATTTGGGACCAGT-3’SEQ ID NO. 4 01igo dT ；上述从双峰驼耳部组织中分离提取总RNA为将双峰驼耳部组织放入装有Trizol 的匀浆器管中匀浆，离心分离，吸取上清液，在15-30°C温育5分钟，加氯仿，剧烈震荡，继续在15-30°C温育2-3分钟，再次离心分离，吸取上清液，加异丙醇混合均匀，然后15-30°C温育10分钟，离心分离，所得沉淀物加75%乙醇洗涤，离心分离后自然干燥或真空干燥得到总RNA。分离提取后的总RNA用分光光度计测定RNA含量和用琼脂糖电泳分析RNA的质量。上述反转录PCR按照大连宝生物反转录试剂盒的要求进行反转录。上述克隆和测序包括PCR扩增片段的回收、回收片段同T载体的连接、质粒的转化、转化菌落的PCR鉴定与培养、质粒的回收、质粒的酶切鉴定和重组质粒的测序。上述PCR扩增片段的回收按照上海华舜小量胶回收试剂盒的要求进行。上述回收片段同T载体的连接用TaKaRa pMD18_T Vector试剂盒。上述质粒的转化为将感受态细胞加入到回收片段同T载体的连接产物中，冰浴 30分钟，然后在42°C水浴热应激90秒钟，立即置入冰浴中2分钟，加液体LB培养基，37°C 复活50分钟，后涂布于含有氨苄青霉的LB平板上，37°C恒温培养10-15小时。 上述转化菌落的PCR鉴定与培养为挑选转化培养的单菌落，放入到加有PCR反应液的EP管中晃动，使单菌落充当模板；用获得该片段的PCR条件进行扩增，PCR产物同 Marker 一起进行琼脂糖凝胶电泳，鉴别T载体上是否含有目的片段；若得到目的片段，可挑取在LB平板上的与之对应的单菌落，放入含有的青霉素钠LB液体培养基中，37°C过夜摇菌培养，用于质粒回收。上述质粒的回收用上海华舜小量质粒抽提纯化试剂盒实现。上述质粒的酶切鉴定采用双酶切法鉴定，选择内切酶Bam H I和Hin d III。本专利技术在提供了双峰驼褪黑素受体基因的cDNA序列和蛋白编码序列基础上；将人、鼠、牛等不同物种褪黑素受体基因的CDS序列和氨基酸序列进行同源性比较；对包括双峰驼在内的8个物种的八个褪黑素受体基因的CDS序列构建了系统发生树。本专利技术是通过以下技术方案实现的本专利技术中的双峰驼褪黑素受体基因的cDNA序列是通过以双峰驼耳部组织中总 RNA为模板，参考人、鼠、牛等物种的褪黑素受体基因的同源序列设计引物，进行反转录PCR 而获得的新基因序列。获得的双峰驼褪黑素受体基因cDNA序列见SEQ ID NO.1。将双峰驼褪黑素受体基因cDNA序列中的编码序列(CDS)按通用密码子翻译成的蛋白质编码序列见 SEQ ID NO. 2。在SEQ ID NO.1中，RT-PCR产物长度为1140bp，电泳结果见附图1，其中19-21位为起始密码子ATG，1105-1107位为终止密码子TAA，19-1107位为编码蛋白质区域(OTS)。 在SEQ ID NO.1，双峰驼褪黑素受体基因编码362个氨基酸。双峰驼与褐家鼠(AAG18471.1) 的褪黑素受体核酸序列具有94%的相似性。双峰驼和人、鼠、牛等动物用Clustal X中对齐的褪黑素受体基因编码氨基酸序列同源性比较结果见附图2。对包括SEQ ID NO.1在内的8个物种的八条褪黑素受体基因的⑶S序列构建了系统发生树，结果发现双峰驼褪黑素受体同褐家鼠的进化距离最近，间接证明了所得到的序列确为双峰驼褪黑素受体基因。本专利技术所得到的褪黑素受体蛋白的基因序列和该蛋白结构的数据可用于研究其在黑素合成的下游途径中的重要作用，为阐明双峰驼绒毛生长机理和未来产生人为控制绒毛产量提供理论基础和依据，并能够为其它哺乳动物的绒毛生长机理研究奠定一定的生物学基础。附图说明图1为双峰驼褪黑素受体基因RT-PCR产物电泳图2为构建系统发生树所用褪黑素受体氨基酸同源性比较；图3为不同物种褪黑素受体氨基酸序列系统进化树。具体实施方式下面实施例用于对本专利技术的进一步说明，但不用来限制本专利技术的保护范围。实施例1:双峰驼褪黑素受体基因cDNA序列的克隆1、组织分离(Isolation)从内蒙古阿拉善盟双峰驼，快速采得样品，将耳部组织样迅速放入液氮中冷冻后于-70°C保存，拿回实验室准备提取组织总RNA。2、总 RNA 的分离(Total RNA isol本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种双峰驼褪黑素受体，其氨基酸序列如下述(a)或(b)所示：(a)SEQ?ID?NO.2所示序列；(b)在(a)限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或／和叠加一个或多个氨基酸衍生得到的，且与(a)编码蛋白质具有相同功能的保守性变异多肽、活性片段或活性衍生物的氨基酸序列。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：张文彬，哈斯苏荣，
申请(专利权)人：张文彬，
类型：发明
国别省市：
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