一种综合利用Cohn组分IV的方法技术

本发明专利技术公开了一种从组分IV中提取人血清白蛋白、免疫球蛋白、转铁蛋白、结合珠蛋白、α2-巨球蛋白、α1-抗胰蛋白酶、铜蓝蛋白、抗凝血酶III、载脂蛋白A1、C1酯酶抑制剂等蛋白的方法。所述方法包括：a）用不同pH值的溶液对沉淀进行分布溶解，将不同的蛋白富集在不同的pH值缓冲液中；b）将溶出液用离子交换层析处理，将组分IV分穿透峰（HSA，IgG，Apo?A1，转铁蛋白）和洗脱峰（结合珠蛋白，α2-巨球蛋白、α1-抗胰蛋白酶、抗凝血酶III、铜蓝蛋白和C1酯酶抑制剂），再进一步针对不同的蛋白采用不同层析处理。本发明专利技术中所述方法蛋白收率高，容易放大，适合工业化生产，实现了目前血浆生产中废弃物的综合利用。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及蛋白制备领域，尤其涉及综合利用Cohn组分IV的方法。
技术介绍
目前，从血浆中制备白蛋白和IgG所采用的大都为Cohn冷乙醇沉淀法。这种方法中的组分IV中主要是含有蛋白，其中包括很多有潜在价值的蛋白质，但现在通常作为废弃物丢掉。其中这些蛋白无论作为临床使用还是作为生化诊断试剂都有着非常广阔的前景。 比如Q1-抗胰蛋白酶可以治疗CI1-抗胰蛋白酶先天性缺乏伴肺气肿患者，是美国FDA批准的药品；α 2-巨球蛋白用于质量放射损伤的治疗以及眼角膜损伤和角膜炎的治疗；补体 I酯酶抑制剂遗传性血管神经性水肿；结合珠蛋白静脉输注结合珠蛋白或用固相化结合珠蛋白体外循环去除血液中的游离血红蛋白，防止和治疗溶血性肾衰竭；运铁蛋白治疗先天性无运铁蛋白血症，用脱铁的运铁蛋白治疗铁血黄素沉着症；铜蓝蛋白促进红细胞生成，治疗贫血。此外血液中的很多检测指标都是针对某一种蛋白的检测，这对于判断疾病类型有着重要的临床意义，而检测试剂盒的制备需要采用纯度非常高的抗原来免疫动物， 得到相应的抗体。这类产品的市场空间也非常大，因为随着技术的成熟，会有越来越多的医院都采用这类检测指标更有效的辅助疾病类型的判断。比如铜蓝蛋白的升高可以作为某些疾病的前兆，现在医院对于载脂蛋白检测的需求也越来越多。目前有一些专门针对组分IV中某一种蛋白质进行分离的报道，比如黄凯等人用尿素溶解组分IV，然后从中提取载脂蛋白Al (CN 101205250Α)，此方法中采用的尿素浓度可以高达6-8Μ，这可能会对组分IV中其它的组分造成潜在的破坏。周燕翔等人米用Con A Sepharose 4Β以及DEAE Sepharose FF从组分IV中分离Ci1-抗胰蛋白酶(周雁翔，端义坤，李策生，彭良俊，张爱华，邹汉武，低温乙醇法分离正常人血浆组分IV沉淀中Ci1-抗胰蛋白酶的分离纯化，中国生物制品学杂质，2011，24: 1090-1093)。Coan等人采用PEG沉淀结合DEAE离子交换层析的方法从组分IV中提取 α f 抗膜蛋白酶(Coan MH, Brockway WJ, Eguizabal H, Krieg T, Fournel M. Preparation and properties of alpha1-proteinaseinhibitor concentrate from human plasma. Vox Sanguinis, 1985，48:333 - 342)。这些方法中要么采用了沉淀技术，要么采用亲和层析技术，所使用的工艺与本专利技术不同。Deutsch等人采用硫酸铵沉淀、DEAE层析以及乙醇-氯仿沉淀的工艺从组分IV 中提取铜蓝蛋白(Deutsch HF, Kasper CB, Walsh DA, Papid method forpreparation of crystalline human ceruloplasmin from Cohn Fraction IV-1. Archives ofBiochemistry and Biophysics, 1962,99:132-135)。该工艺采用两步沉淀，而且其中一步沉淀为含有氯仿的有机溶剂沉淀，对蛋白质的破坏比较大。目前也从组分IV同时提取多种蛋白的报道，处理过程包括先对组分IV进行 PEG沉淀处理，然后再依次用疏水层析和离子交换层析处理，能够得到的蛋白包括5种 (白高英，Cohn组分IV沉淀中血浆蛋白的分离工艺及过程自动化研究，2010，兰州大学硕士生学位论文；Kong YJ, Li XN, Bai GY, Ma GH, SuZG. An automatic system for multidimensional integrated protein chromatography, Journal of Chromatography A, 2010, 1217:6898-6904)。此方法中采用了蛋白损失率较高的沉淀步骤，而且所采用层析的顺序也与本专利技术存在不同。这些方法虽然能够得到比较高纯度的蛋白，但是往往具有如下缺点①在纯化过程中往往不得不牺牲其它的蛋白质组分，或者将其它的蛋白往往作为废弃物丢弃了，这对于宝贵的血液资源也是一种浪费；②这些方法包括超速离心法，沉淀法等等，处理量比较小，蛋白的损失比较多蛋白质的收率比较低，纯化步骤多，有的纯化中还涉及有机溶剂或者变性剂，不利于蛋白质活性的保持；④采用抗体或者抗体片段亲和层析技术针对某种蛋白进行纯化，虽然效率比较高，但是由于亲和介质的价格比较贵而且稳定性可能存在问题，所以仅适合实验室用，而不适合工业生产放大；因此，本领域非常需要一种能够充分利用组分IV中丰富而且宝贵的蛋白资源的方法。该方法的蛋白质得率高，过程中不涉及有机溶剂和变性剂，容易放大适合工业生产。具体实施方式下面结合附图并通过具体实施方式来进一步说明本专利技术的技术方案。本专利技术旨在提供一种综合利用组分IV的方法。该方法的蛋白质得率高，过程中不涉及有机溶剂和变性剂，容易放大进行工业生产。为达此目的，本专利技术采用以下技术方案一种综合利用组分IV的方法，其特征在于，所述方法包括步骤a :将Cohn低温乙醇法获得的组分IV溶液I溶解，分离沉淀，获得上清I和沉淀I，将所述沉淀I溶液II溶解，分离沉淀，获得上清II和沉淀II，再将所述沉淀II溶液III溶解，分离沉淀，获得上清 III ;其中，优选地，所述溶液I为酸性缓冲溶液，pH值为优选地3. 8-5. 2、更优选地 4. 1-4. 8、最优选地4. 3-4. 5，浓度为优选地0. OIM-0. 5M、更优选地0. 01-0. 2M、最优选地 O. 02-0. 05M，所述溶液II为中性缓冲溶液，pH值为优选地6. 0-7. 5、更优选地6. 3-7. 2、最优选地6. 5-7. 0，浓度为优选地0. OIM-0. 5M、更优选地0. 01-0. 2M、最优选地0. 02-0. 05M和 /或所述溶液III为碱性缓冲溶液，PH值为优选地8. 0-9. 5、更优选地8. 3-9. 2、最优选地 8. 5-9. O,浓度为优选地0. OIM-0. 5M、更优选地0. 01-0. 2M、最优选地0. 02-0. 05M,且优选地，所述酸性缓冲溶液的缓冲体系包括但不限于醋酸-醋酸钠体系和柠檬酸-柠檬酸钠体系、所述中性缓冲溶液的缓冲体系包括但不限于磷酸盐缓冲体系和Tris-HCl缓冲体系和 /或所述碱性缓冲溶液的缓冲体系包括但不限于Tris-HCl缓冲体系和硼酸-硼砂缓冲体优选地，所述组分IV与所述溶液I、所述溶液II和所述溶液III的质量比分别为 1:500-1:1，更优选地 1:100-1:2，最优选地 1:10-1:4，优选地，所述分离通过离心来进行，优选地，所述步骤a在0-4 °C下进行。本专利技术的综合利用组分IV的方法，所述方法还可包括步骤b :将上清I经由离子交换层析柱分离，收集穿透峰，获得组分A，之后用洗脱缓冲液I洗脱，获得组分B，最后用洗8脱缓冲液II洗脱，获得α 2-巨球蛋白，其中，分离过程中所用的平衡缓冲液为平衡缓冲液 I ;其中，优选地，所述平衡缓冲液I的缓冲体系包括但不限于醋酸-醋酸钠体系或者柠檬酸-柠檬酸钠体系，pH本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种综合利用组分IV的方法，其特征在于，所述方法包括步骤a：将Cohn低温乙醇法获得的组分IV溶液I溶解，分离沉淀，获得上清I和沉淀I，将所述沉淀I溶液II溶解，分离沉淀，获得上清II和沉淀II，再将所述沉淀II溶液III溶解，分离沉淀，获得上清III；其中，优选地，所述溶液I为酸性缓冲溶液，pH值为优选地3.8?5.2、更优选地4.1?4.8、最优选地4.3?4.5，浓度为优选地0.01M?0.5M、更优选地0.01?0.2M、最优选地0.02?0.05M，所述溶液II为中性缓冲溶液，pH值为优选地6.0?7.5、更优选地6.3?7.2、最优选地6.5?7.0，浓度为优选地0.01M?0.5M、更优选地0.01?0.2M、最优选地0.02?0.05M和/或所述溶液III为碱性缓冲溶液，pH值为优选地8.0?9.5、更优选地8.3?9.2、最优选地8.5?9.0，浓度为优选地0.01M?0.5M、更优选地0.01?0.2M、最优选地0.02?0.05M，且优选地，所述酸性缓冲溶液的缓冲体系包括但不限于醋酸?醋酸钠体系和柠檬酸?柠檬酸钠体系、所述中性缓冲溶液的缓冲体系包括但不限于磷酸盐缓冲体系和Tris?HCl缓冲体系和/或所述碱性缓冲溶液的缓冲体系包括但不限于Tris?HCl缓冲体系和硼酸?硼砂缓冲体系；优选地，所述组分IV与所述溶液I、所述溶液II和所述溶液III的质量比分别为1:500?1:1，更优选地1:100?1:2，最优选地1:10?1:4，优选地，所述分离通过离心来进行，优选地，所述步骤a在0?4℃下进行。...

【技术特征摘要】
1.一种综合利用组分IV的方法，其特征在于，所述方法包括步骤a :将Cohn低温乙醇法获得的组分IV溶液I溶解，分离沉淀，获得上清I和沉淀I，将所述沉淀I溶液II溶解，分离沉淀，获得上清II和沉淀II，再将所述沉淀II溶液III溶解，分离沉淀，获得上清III ； 其中，优选地，所述溶液I为酸性缓冲溶液，pH值为优选地3. 8-5. 2、更优选地4. 1-4. 8、最优选地4. 3-4. 5，浓度为优选地0. 01M-0. 5M、更优选地0. 01-0. 2M、最优选地0. 02-0. 05M,所述溶液II为中性缓冲溶液，pH值为优选地6. 0-7. 5、更优选地6. 3-7. 2、最优选地6.5-7. 0，浓度为优选地0. 01M-0. 5M、更优选地0. 01-0. 2M、最优选地0. 02-0. 05M和/或所述溶液III为碱性缓冲溶液，pH值为优选地8. 0-9. 5、更优选地8. 3-9. 2、最优选地8.5-9. 0，浓度为优选地0. 01M-0. 5M、更优选地0. 01-0. 2M、最优选地0. 02-0. 05M,且优选地，所述酸性缓冲溶液的缓冲体系包括但不限于醋酸_醋酸钠体系和柠檬酸_柠檬酸钠体系、所述中性缓冲溶液的缓冲体系包括但不限于磷酸盐缓冲体系和Tris-HCl缓冲体系和/或所述碱性缓冲溶液的缓冲体系包括但不限于Tris-HCl缓冲体系和硼酸-硼砂缓冲体系; 优选地，所述组分IV与所述溶液I、所述溶液II和所述溶液III的质量比分别为1:500-1:1，更优选地 1:100-1:2，最优选地 1:10-1:4， 优选地，所述分离通过离心来进行， 优选地，所述步骤a在0-4 °C下进行。2.如权利要求I所述的方法，其特征在于，所述方法还包括步骤b:将上清I经由离子交换层析柱分离，收集穿透峰，获得组分A，之后用洗脱缓冲液I洗脱，获得组分B，最后用洗脱缓冲液II洗脱，获得a2-巨球蛋白，其中，分离过程中所用的平衡缓冲液为平衡缓冲液I ; 其中，优选地，所述平衡缓冲液I的缓冲体系包括但不限于醋酸-醋酸钠体系或者柠檬酸-柠檬酸钠体系，PH值为3. 5-5. 2、优选地3. 8-5. O、更优选地4. 1-4. 9、最优选地4.2-4. 6，浓度为 5-200mM、优选地 10-100mM、更优选地 20_40mM， 优选地，所述洗脱缓冲液I为在所述平衡缓冲液I中加入包括但不限于NaCl、KC1、NaBr、KBr和MgCl2,优选地NaCl、KCl和NaBr，更优选地NaCl的另外的盐，所述洗脱缓冲液I的盐浓度为0. 05-0. 15M、优选地0. 08-0. 12M、更优选地0. 1M， 优选地，所述洗脱缓冲液II为在所述平衡缓冲液I中加入包括但不限于NaCl、KC1、NaBr、KBr和MgCl2,优选地NaCl、KCl和NaBr，更优选地NaCl的另外的盐，所述洗脱缓冲液II的盐浓度为0. 18-0. 35M、优选地0. 2-0. 3M、更优选地0. 25M， 优选地，所述离子交换层析介质包括但是不限于中国科学院过程工程研究所生产的的 DEAE 以及 Q 琼脂糖介质，或者 GE 公司的 DEAE Sepharose FF、Q Sepharose FF、ANXSepharose FF high sub、ANX Sepharose FF low sub、QSepharoseXL、Capto DEAE 以及Capto Q03.如权利要求I或2所述的方法，其特征在于，所述方法还包括步骤c:将上清II的pH值调节至所述平衡缓冲液I的PH值，经由离子交换层析柱分离，收集穿透峰，获得组分C，之后用所述洗脱缓冲液I洗脱，获得组分D和根据610nm处的特征吸收收集的富含铜蓝蛋白的组分E，最后用所述洗脱缓冲液II洗脱，获得Ci2-巨球蛋白，其中，分离过程中所用的平衡缓冲液为所述平衡缓冲液I ;其中，优选地，所述平衡缓冲液I的缓冲体系包括但不限于醋酸-醋酸钠体系或者柠檬酸-柠檬酸钠体系，PH值为3. 5-5. 2、优选地3. 8-5. O、更优选地4. 1-4. 9、最优选地4.2-4. 6，浓度为 5-200mM、优选地 10-100mM、更优选地 20_40mM， 优选地，所述洗脱缓冲液I为在所述平衡缓冲液I中加入包括但不限于NaCl、KC1、NaBr、KBr和MgCl2,优选地NaCl、KCl和NaBr，更优选地NaCl的另外的盐，所述洗脱缓冲液I的盐浓度为0. 05-0. 15M、优选地0. 08-0. 12M、更优选地0. 1M， 优选地，所述洗脱缓冲液II为在所述平衡缓冲液I中加入包括但不限于NaCl、KC1、NaBr、KBr和MgCl2,优选地NaCl、KCl和NaBr，更优选地NaCl的另外的盐，所述洗脱缓冲液II的盐浓度为0. 18-0. 35M、优选地0. 2-0. 3M、更优选地0. 25M， 优选地，所述离子交换层析介质包括但是不限于中国科学院过程工程研究所生产的的 DEAE 以及 Q 琼脂糖介质，或者 GE 公司的 DEAE Sepharose FF、Q Sepharose FF、ANXSepharose FF high sub、ANX Sepharose FF low sub、QSepharoseXL、Capto DEAE 以及Capto Q04.如权利要求I至3中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法还包括步骤d:将上清III的PH值调节至所述平衡缓冲液I的pH值，经由离子交换层析柱分离，收集穿透峰，获得组分F，之后用所述洗脱缓冲液I洗脱，获得组分G，最后用所述洗脱缓冲液II洗脱，获得a2-巨球蛋白，其中，分离过程中所用的平衡缓冲液为所述平衡缓冲液I ; 其中，优选地，所述平衡缓冲液I的缓冲体系包括但不限于醋酸-醋酸钠体系或者柠檬酸-柠檬酸钠体系，PH值为3. 5-5. 2、优选地3. 8-5. O、更优选地4. 1-4. 9、最优选地4.2-4. 6，浓度为 5-200mM、优选地 10-100mM、更优选地 20_40mM， 优选地，所述洗脱缓冲液I为在所述平衡缓冲液I中加入包括但不限于NaCl、KC1、NaBr、KBr和MgCl2,优选地NaCl、KCl和NaBr，更优选地NaCl的另外的盐，所述洗脱缓冲液I的盐浓度为0. 05-0. 15M、优选地0. 08-0. 12M、更优选地0. 1M， 优选地，所述洗脱缓冲液II为在所述平衡缓冲液I中加入包括但不限于NaCl、KC1、NaBr、KBr和MgCl2,优选地NaCl、KCl和NaBr，更优选地NaCl的另外的盐，所述洗脱缓冲液II的盐浓度为0. 18-0. 35M、优选地0. 2-0. 3M、更优选地0. 25M， 优选地，所述离子交换层析介质包括但是不限于中国科学院过程工程研究所生产的的 DEAE 以及 Q 琼脂糖介质，或者 GE 公司的 DEAE Sepharose FF、Q Sepharose FF、ANXSepharose FF high sub、ANX Sepharose FF low sub、QSepharoseXL、Capto DEAE 以及Capto Q05.如权利要求2至4中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法还包括步骤e:将组分A、C、F或其组合的pH值调节至平衡缓冲液II的pH值，经由离子交换层析柱分离，收集穿透峰，获得免疫球蛋白，用洗脱缓冲液III洗脱获得转铁蛋白，再用洗脱缓冲液IV洗脱获得白蛋白和载脂蛋白Al的混合物，将所述白蛋白和载脂蛋白Al的混合物的盐浓度调节至平衡缓冲液III的盐浓度，经由疏水层析柱分离，用洗脱缓冲液V洗脱获得白蛋白，再用洗脱缓冲液VI洗脱获得载脂蛋白Al ;其中，离子交换层析柱分离过程中所用的平衡缓冲液为所述平衡缓冲液II，疏水层析分离过程中所使用的平衡缓冲液为所述平衡缓冲液III ; 其中，优选地，所述平衡缓冲液II的缓冲体系包括但不限于磷酸-磷酸盐或者Tris-HCl缓冲体系，pH值为6. 0-8. O、优选地6. 5-7. 5M、更优选地6. 8-7. 2M，浓度为5-200mM、优选地 10-100mM、更优选地 20_40mM， 优选地，所述平衡缓冲液III的缓冲体系包括但不限于磷酸_磷酸盐或者Tris-HCl缓冲体系，PH值为6. 0-8. O、优选地6. 5-7. 5、更优选地6. 8-7. 2，且所述平衡缓冲液III还含有包括但不限于(NH4)2SCV K2SO4, Na2SO4, NaH2PO4 和 Na2HPO4,优选地(NH4) 2S04、K2SO4 和Na2SO4，更优选地(NH4)2SO4的另外的盐，所述平衡缓冲液III的盐浓度为I. 5-0. 8M，优选地I.2-0. 8M，最优选地1M， 优选地，所述洗脱缓冲液III为在所述平衡缓冲液II中加入包括但不限于NaCl、KCl、NaBr、KBr和MgCl2,优选地NaCl、KCl和NaBr，更优选地NaCl的另外的盐，所述洗脱缓冲液III的盐浓度为0. 05-0. 15M、优选地0. 06-0. 14M、更优选地0. 08-0. 12...

【专利技术属性】
技术研发人员：苏志国，李岩，杨延丽，于孟冉，
申请(专利权)人：中国科学院过程工程研究所，
类型：发明
国别省市：