本发明专利技术涉及一种重组羧酸酯酶D-1CarE5的制备方法及其在农药马拉硫磷降解中的应用。用大肠杆菌羧酸酯酶D-1CarE5工程菌，经α-乳糖诱导表达16h，产生大量的可溶性重组羧酸酯酶D-1CarE5蛋白，使用Ni2+-NTA重力纯化柱对其进行纯化。以β-乙酸萘酯为底物对重组羧酸酯酶D-1CarE5性质进行酶活测定。应用方法为：在含有浓度为5.5mg/L农药马拉硫磷、pH7.0、1/15mol/L的磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液中添加1U（以β-乙酸萘酯为底物测酶活性）的羧酸酯酶D-1CarE5，总反应体系3ml，温度37℃条件下震荡反应，对终浓度为5.5mg/L农药马拉硫磷进行降解。降解结果显示，25min内就有50%的马拉硫磷被降解，100min内有89%的马拉硫磷被降解，证明重组羧酸酯酶D-1CarE5在农药残留或农药污染的治理方面具有较好的效果。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及重组羧酸酯酶D-1CarE5的制备方法及其在农药马拉硫磷降解中的应用，属于生物
技术介绍
羧酸酯酶（Carboxylesterases, E C3.1.1.1）是一类能够催化水解羧酸酯生成羧酸和醇的非特异性酯酶，与脂肪酶同属于α/β水解酶家族成员，其氨基酸序列含有Ser-Asp -His三联体结构，Ser，Asp，His构成了羧酸脂酶的催化活性中心（Nardini, M, et al., Current Opinion in Structural Biology. 1999, 9(6):732-737.）。羧酸脂酶广泛存在于动物、植物、微生物中(Melloney J., et al., Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic. 2005, 32:261-270.)，其中微生物来源的羧酸酯酶是一种重要的工业酶类，在催化酯水解、酯合成、酯交换等上有重要应用价值，具有良好的区域选择性和立体选择性（Ramos Tombo, et al., Agricultural and Biological Chemistry. 1987, 51:1833-1838.）。这些独特性质使羧酸酯酶在食品、化工、制药、能源开发和环境保护等领域具有广阔的应用前景（Jaeger K.E., et al., Trends in Biotechnology. 1998, 16(9):396-403.）。当前农业生产中，70%使用的农药是有机磷农药，而70%的有机磷农药又是高毒农药，这些农药的使用很容易在农产品中残留，进而影响到人的健康。利用微生物降解农药残留大多数是依靠胞内酶的酶解作用，但由于野生菌株产酶能力有限、发酵周期长、纯化复杂、难以大量生产，生产成本高，限制了其推广应用。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种重组羧酸酯酶D-1CarE5的制备方法及其在农药马拉硫磷降解中的应用。本专利技术的重组羧酸酯酶D-1CarE5的制备方法如下：1）大肠杆菌羧酸酯酶D-1CarE5工程菌以0.1%的接种量接种于LB培养液中，37 ℃快速振荡12 h，然后将此活化的菌液以1%接种量接种到新鲜的LB（含50 μg/mL Kan和0.5%（w/v）α-乳糖）诱导培养液中，振荡培养16 h，12000 rpm离心5 min，收集菌体；用适量的pH7.0 Tris-HCl缓冲液悬浮菌体后，于冰水混合物下超声波破碎菌体，以上胞内浓缩的粗酶液经13,000 rpm离心10 min后，吸取上清液用Nickel-NTA Agarose来纯化目的蛋白；2）纯化：将2 mL的Nickel-NTA Agarose装到空柱子中，用以下缓冲液，pH均为7.0：NTA-0：20mM Tris-HCl，0.5M NaCl，10%（w/v）甘油；NTA-20：20mM Tris-HCl，20mM 咪唑，0.5M NaCl，10%（w/v）甘油；NTA-40：20mM Tris-HCl，40mM 咪唑，0.5M NaCl，10%（w/v）甘油；NTA-60：20mM Tris-HCl，60mM 咪唑，0.5M NaCl，10%（w/v）甘油；NTA-80：20mM Tris-HCl，80mM 咪唑，0.5M NaCl，10%（w/v）甘油；NTA-100：20mM Tris-HCl，100mM 咪唑，0.5M NaCl，10%（w/v）甘油；NTA-200：20mM Tris-HCl，200mM 咪唑，0.5M NaCl，10%（w/v）甘油；NTA-300：20mM Tris-HCl，300mM 咪唑，0.5M NaCl，10%（w/v）甘油；NTA-500：20mM Tris-HCl，500mM 咪唑，0.5M NaCl，10%（w/v）甘油；纯化步骤为：（1）20 mL的水平衡；（2）20 mL的NTA-0平衡；（3）加样品2 mL；（4）收集穿透峰；（5）分别用2 mL的NTA-20、NTA-40、NTA-60、NTA-80、NTA-100、NTA-200、NTA-300、NTA-500依次洗脱，并分别收集洗脱液；（6）将洗脱液分别以β-乙酸萘酯为底物进行酶活测定（进而确定纯化条件，为大批量的目的蛋白的纯化做准备）；（7）纯化后的酶液通过酶活测定和蛋白质电泳鉴定后，-20℃保存备用；羧酸酯酶D-1CarE5氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，基因序列如SEQ ID NO.2。构建羧酸酯酶D-1CarE5工程菌所用的载体为pET28a(+)，宿主菌为大肠杆菌BL21(DE3)。羧酸酯酶D-1CarE5可得自嗜热脂环芽孢杆菌（thermophilic Alicyclobacillus tengchongensisstrain CGMCC1504）。SDS-PAGE结果（图1）表明，重组羧酸酯酶D-1CarE5在大肠杆菌中得到了表达，经Nickel-NTA Agarose纯化后为单一条带。本专利技术的重组羧酸酯酶D-1CarE5以β-乙酸萘酯为底物测定其酶学性质：最适温度为60 ℃，最适pH为7.0，在温度37 ℃和pH7.0条件下保温50 min酶活力基本保持稳定，金属离子Pb2+和Mg2+有激活作用，Hg2+、Zn2+、Al3+、Cu2+和Ag+等有较强的抑制作用，酶促动力学参数测定Km和Vmax值分别为2.64 mM和1.7 U/mg。羧酸酯酶是一种重要的农药降解酶，其对含有羧酸酯键的有机磷化合物，如马拉硫磷，羧酸酯酶靠活性中心丝氨酸的可逆酰化作用来完成降解。这个酰化作用释放出一个醇部分和一个对应的共价酰化酶。这个酰化的中间体由于水的亲核作用释放出对应的羧酸部分和有活性的酶，它可以重新来催化新一轮的降解反应。本专利技术的重组羧酸酯酶D-1CarE5对农药马拉硫磷的降解如下：在含有浓度为5.5 mg/L农药马拉硫磷、pH7.0 、1/15mol/L的磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液中添加1 U（以β-乙酸萘酯为底物测酶活性）的羧酸酯酶D-1CarE5，总反应体系3 ml，温度37 ℃条件下震荡反应，对终浓度为5.5 mg/L农药马拉硫磷进行降解。降解效果显示，25 min内就有50%的马拉硫磷被降解，100 min内有89%的马拉硫磷被降解，说明羧酸酯酶D-1CarE5在农药残留或农药污染的治理方面具有较好的效果。 本专利技术来源于嗜热脂环芽孢杆菌（thermophilic Alicyclobacillus tengchongensisstrain CGMCC1504）的羧酸酯酶D-1CarE5在大肠杆菌中进行异源表达，经过α-乳糖诱导一步培养就可以获得大量可溶性蛋白，通过Nickel-NTA Agarose一步纯化即可获得较纯蛋白，并具有优良的酶学性质。对农药马拉硫磷降解研究发本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种重组羧酸酯酶D？1CarE5的制备方法，其特征在于按以下进行：？1）取大肠杆菌羧酸酯酶D？1CarE5工程菌株以0.1%的接种量接种于LB培养液中，37？℃快速振荡12？h，然后将此活化的菌液以1%接种量接种到新鲜的LB诱导培养液中，其含50？μg/mL？Kan和0.5%？w/v？α？乳糖，振荡培养16？h，12000？rpm离心5？min，收集菌体；用适量的pH7.0？Tris？HCl缓冲液悬浮菌体后，于冰水混合物下超声波破碎菌体，以上胞内浓缩的粗酶液经13,000？rpm离心10？min后，吸取上清液用Nickel？NTA？？Agarose来纯化目的蛋白；2）纯化：将2？mL的Nickel？NTA？？Agarose装到空柱子中，用以下缓冲液，pH均为7.0：NTA？0：20mM？Tris？HCl，0.5M？NaCl，10%（w/v）甘油；NTA？20：20mM？Tris？HCl，20mM？咪唑，0.5M？NaCl，10%（w/v）甘油；NTA？40：20mM？Tris？HCl，40mM？咪唑，0.5M？NaCl，10%（w/v）甘油；NTA？60：20mM？Tris？HCl，60mM？咪唑，0.5M？NaCl，10%（w/v）甘油；NTA？80：20mM？Tris？HCl，80mM？咪唑，0.5M？NaCl，10%（w/v）甘油；NTA？100：20mM？Tris？HCl，100mM？咪唑，0.5M？NaCl，10%（w/v）甘油；NTA？200：20mM？Tris？HCl，200mM？咪唑，0.5M？NaCl，10%（w/v）甘油；NTA？300：20mM？Tris？HCl，300mM？咪唑，0.5M？NaCl，10%（w/v）甘油；NTA？500：20mM？Tris？HCl，500mM？咪唑，0.5M？NaCl，10%（w/v）甘油；纯化步骤为：（a）20？mL的水平衡；（b）20？mL的NTA？0平衡；（c）加样品2？mL；（d）收集穿透峰；（e）分别用2？mL的NTA？20、NTA？40、NTA？60、NTA？80、NTA？100、NTA？200、NTA？300、NTA？500依次洗脱，并分别收集洗脱液；（f）将洗脱液分别以β？乙酸萘酯为底物进行酶活测定；（g）纯化后的酶液通过酶活测定和蛋白质电泳鉴定后，？20℃保存备用；羧酸酯酶D？1CarE5氨基酸序列如SEQ？ID？NO.1所示，基因序列如SEQ？ID？NO.2，构建羧酸酯酶D？1CarE5工程菌所用的载体为pET28a(+)，宿主菌为大肠杆菌BL21(DE3)。...
【技术特征摘要】
1.一种重组羧酸酯酶D-1CarE5的制备方法，其特征在于按以下进行：
1）取大肠杆菌羧酸酯酶D-1CarE5工程菌株以0.1%的接种量接种于LB培养液中，37 ℃快速振荡12 h，然后将此活化的菌液以1%接种量接种到新鲜的LB诱导培养液中，其含50 μg/mL Kan和0.5% w/v α-乳糖，振荡培养16 h，12000 rpm离心5 min，收集菌体；用适量的pH7.0 Tris-HCl缓冲液悬浮菌体后，于冰水混合物下超声波破碎菌体，以上胞内浓缩的粗酶液经13,000 rpm离心10 min后，吸取上清液用Nickel-NTA Agarose来纯化目的蛋白；
2）纯化：
将2 mL的Nickel-NTA Agarose装到空柱子中，用以下缓冲液，pH均为7.0：
NTA-0：20mM Tris-HCl，0.5M NaCl，10%（w/v）甘油；
NTA-20：20mM Tris-HCl，20mM 咪唑，0.5M NaCl，10%（w/v）甘油；
NTA-40：20mM Tris-HCl，40mM 咪唑，0.5M NaCl，10%（w/v）甘油；
NTA-60：20mM Tris-HCl，60mM 咪唑，0.5M NaCl，10%（w/v）甘油；
NTA-80：20mM Tris-HCl，80mM 咪唑，0.5M NaCl，10%（w/v）甘油；
NTA-100：20mM Tris-HCl，100mM 咪唑，0.5M NaCl，10%（w/v）甘油；
NTA-200：20mM Tris-HCl，200mM 咪唑...
【专利技术属性】
技术研发人员：黄遵锡，谢振荣，李俊俊，丁俊美，周峻沛，唐湘华，杨云娟，许波，
申请(专利权)人：云南师范大学，
类型：发明
国别省市：
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