获得生物活性的重组人G-CSF的方法技术

本发明专利技术提供了从包含体获得生物活性的重组人G-CSF的方法，其中增溶和重折叠过程可以在环境温度下执行，并且纯化步骤包括反相色谱(RP)，特别是RP-HPLC。如此获得的G-CSF制备物的特征为高纯度和均质性。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及高活性和纯度形式的粒细胞-集落刺激因子(G-CSF)、特别是重组人G-CSF (rhG-CSF)的生产过程。其通过在环境温度下在适当的氧化还原系统中将溶解的包含体中包含的G-CSF重折叠并在纯化过程中使用至少一个反相(RP)色谱步骤而实现。
技术介绍
G-CSF(粒细胞集落刺激因子)是一种主要由单核细胞和成纤维细胞释放的造血细胞因子，它刺激颗粒细胞谱系的前体细胞的增殖和分化，并激活功能成熟的中性粒细胞。由于所述特性，G-CSF已经用于不同的医学领域，像例如在化疗或放疗之后重建正常血细胞种群或刺激针对感染性病原体的免疫应答。因此在临床中，G-CSF主要用于抗肿瘤治疗，特别是治疗由于化疗造成的中性粒细胞减少，并还用于骨髓移植和治疗感染性疾病。 市场上可买到的第一种基于重组G-CSF的G-CSF制备物是Amgen生产和经销的商品名为N eupogen 的产品。天然存在形式的人G-CSF是分子量约20，000道尔顿并具有五个半胱氨酸残基的糖蛋白。这些残基中的四个形成两个分子内二硫桥，所述二硫桥对于蛋白质的活性具有必不可少的重要性。重组形式的G-CSF主要用于生产药品，其可以例如借助于在哺乳动物细胞如CHO(中华仓鼠卵巢)细胞中或原核细胞如大肠杆菌(E. coli)中表达而获得。当重组蛋白质在原核生物中表达时，所述蛋白质往往以至少部分无活性的、不溶的聚集体(折射体，包含体IB)形式在寄主细胞内产生。在这样的蛋白质能被使用之前，它们必须转变成它们的活性形式。所述包含体的形成造成了在通过中速离心分离包含体之后，有必要借助合适的方法对蛋白质进行增溶和复性以保持其活性构型。由包含体获得的重组蛋白质的复性过程通常是已知的并记载于例如EP 0114506、WO 84/03711、US 4，530，787和EP 0241022中。另外，关于变性蛋白的增溶和复性的一般技术已经记载于EP 0512097, EP 0364926, EP 0219874和WO 01/87925中并还可以获自蛋白质化学的科学文献和权威著作。EP 0500108描述了使用还原型谷胱甘肽(GSH)和氧化型谷胱甘肽(GSSH)氧化还原系统激活来自包含体的无活性形式的人重组G-CSF并分析G-CSF在一定条件下的再活化动力学的方法。然而没有公开下游的纯化过程。在EP 0719860中，将含有G-CSF的包含体用N-月桂酰肌氨酸(十二烷基肌氨酸钠)增溶，随后利用硫酸铜通过空气-氧化来实现重折叠。这种方法的缺点是副反应，例如，在氨基酸侧链上形成超氧化物自由基。此外，所述重折叠过程是耗时的并且难以得到标准化的重折叠参数。最后，除去变性剂包含色谱步骤，这导致约20%的总蛋白收率损失。得到的G-CSF随后通过阴离子交换色谱和阳离子交换色谱纯化。EP 1630173和EP 1837346描述了使用还原型谷胱甘肽(GSH)和氧化型谷胱甘肽(GSSH)氧化还原系统从包含体获得人重组G-CSF的方法，其中重折叠步骤在低温下执行半天以上。因此，在工业规模下，由于要冷却大量的蛋白质溶液达许多小时，这种过程是耗能因此也是耗成本的。由此产生的G-CSF随后通过阳离子交换色谱纯化。在W02007/009950中，将EP 1630173中所教示的G-CSF纯化方法在色谱步骤方面进行了进一步的详细说明，即阳离子交换色谱和疏水作用层析顺序执行，两者之间没有任何居间步骤。具体是，色谱纯化步骤分别在疏水作用层析之前和之后，包含两个阳离子交换色谱步骤的序列。然而，虽然提供治疗级的纯化G-CSF的手段和方法在现有技术中是已知的，但迄今为止从包含体获得G-CSF的过程，特别是在商业规模下，通常是耗时、耗力和耗成本的。这种技术问题通过在权利要求书中作为特征的和下文描述的实施方式得以解决。另外，如下文所述，这些实施方式提供了 G-CSF构象亚型的分离，因此提供了高度均质的G-CSF制备物。
技术实现思路
本专利技术提供了从产生G-CSF的重组细胞回收和纯化粒细胞集落刺激因子 (rhG-CSF)的方法。所述方法包括对来自包含体的重组蛋白质进行增溶，通过在适度温度、优选>10° C的重折叠缓冲液内简单稀释所述增溶物而重折叠所述G-CSF分子，并通过色谱纯化重折叠的G-CSF，其中至少一个色谱步骤包含反相(RP)色谱。这种方法通常的特征在于(a)用含有变性剂和还原剂的增溶缓冲液来增溶包含体中所含的G-CSF，(b)通过用含有还原型和氧化型谷胱甘肽的重折叠缓冲液在>10° C的温度下稀释增溶物来重折叠G-CSF ;和(C)通过至少一个优选包含反相(RP)色谱的色谱步骤来纯化重折叠的G-CSF。具体地说，在一方面，本专利技术基于在合适的氧化还原系统中在超过10° C的温度下在小于半天内进行的重折叠过程，并且有利地是在室温、即在20±2° C下在3至4小时内进行的重折叠过程。在这些条件下除了可以实现G-CSF分子的有效和准确的复性这一事实之外，还可以避免上文提到的现有技术中描述的现有方法的缺点。因此，本专利技术的方法容易执行、耗时较少并且不包括耗能的冷却系统。此外，本专利技术的方法是基于意料之外的观察结果在生产和回收G-CSF的过程中，形成了至少一种只有在60° C通过应用分析型反相高压液相色谱法(RP-HPLC)才变得可见的G-CSF亚型；参见图3，表明疏水性稍低于主要形式。这种另外的错误折叠的G-CSF亚型的结构特点如下面所述被详细研究和进一步表征。这种另外的G-CSF亚型在整体制备物中的最大含量可以高达总G-CSF蛋白质收率的7%。利用CD光谱学的详细分析揭示，所述G-CSF亚型与主题G-CSF参照的不同之处在于α-螺旋结构的含量更高(所述亚型为66%，G-CSF参照为52%)。这种另外的亚型的一种特征性质在于它与G-CSF参照标准和本专利技术的G-CSF制备物的主要部分相比疏水性较低，因此它可以被分离并进而几乎完全从所述制备物中排除出去。结果，在本专利技术方法内加入RP色谱步骤、特别是RP-HPLC作为工艺步骤，产生了改善的、即高度纯化的G-CSF制备物，其基本上不含这种亚型和其他产品相关的杂质，即疏水性较低的G-CSF亚型含量保持在总G-CSF蛋白质的低于1%。在这种情况下，RP色谱法有别于不是本专利技术方法的优选实施方式的疏水作用层析(HIC)。因此，对于G-CSF的纯化而言，RP和RP-HPLC迄今分别只用于分析目的；参见，例如，W02007/009950。所提到的色谱原理在行家当中也是有明确区别的(参见，例如，Bioanalytik, F. Lottspeich, H.Zorbas (编著)，Heidelberg, Berlin, Germany, Spektrum Akad. Verlagl998)。例如，虽然HIC典型是水洗脱的，但RP是溶剂洗脱的，其中洗脱以向着溶剂例如乙腈或乙醇的更高浓度的梯度来完成。优选，所述色谱步骤包括在适当条件下的RP-高压液相色谱(HPLC)，应用在阳离子交换(CEX)色谱之后。在这种情况下，可以审慎地假定，在从包含体获得G-CSF的现有技术的方法中，也形成了 G-CSF的亚型，但是迄今尚没有检出，因为在现有技术中使用的分析型RP-HPLC的条件下，所述亚型不明本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：瓦尔特·因德雷尔，克里斯蒂安·舍克尔曼，
申请(专利权)人：百奥杰诺瑞克斯有限公司，
类型：
国别省市：