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双峰驼酪氨酶、编码基因及其获取方法技术

技术编号:8211779 阅读:186 留言:0更新日期:2013-01-17 04:39
本发明专利技术涉及一种在双峰驼酪氨酸酶基因、编码蛋白及其双峰驼酪氨酸酶基因获取方法,本发明专利技术通过以双峰驼组织中总RNA为模板,参考人、鼠、牛等物种的酪氨酸酶基因的同源序列设计引物,进行反转录PCR而获得的新基因序列。获得的双峰驼酪氨酸酶基因cDNA序列见SEQ?ID?NO.1。将双峰驼酪氨酸酶基因cDNA序列中的编码序列(CDS)按通用密码子翻译成的蛋白质编码序列见SEQ?ID?NO.2。本发明专利技术对包括SEQ?ID?NO.1在内的10个物种的十条酪氨酸酶基因的CDS序列构建了系统发生树,结果发现:双峰驼酪氨酸酶同牛和绵羊的进化距离最近,间接证明了所得到的序列确为双峰驼酪氨酸酶基因。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于基因工程
,特别是涉及一种在双峰驼酪氨酸酶、编码基因及其获取方法。
技术介绍
酪氨酸酶(Tyrosinase,TYR)是一种75kD含铜酶,来源于胚胎神经峭细胞,是黑素代谢和儿茶酚胺的关键酶。Spritz等证实人TYR是一种铜结合蛋白,有铜A和铜B位点。离子铜特异性能与人TYR结合,一个位点的铜结合可以促进另一个位点的铜结合。酪氨酸酶在黑色素生物合成过程中,起着重要的催化作用,是迄今已知唯一参与黑色素生物合成的酶。研究发现,酪氨酸酶是一种具有多种生物学功能的蛋白质。主要存在于黑素细胞 中的黑素体内,绝大部分与黑素体膜相结合,只有极少数以游离的状态存在。TYR的多肽链的适当折叠对铜结合及其催化活性是关键性的,TYR突变可中断铜结合使其催化活性丧失。酪氨酸酶是一种独特的具有双重催化功能的酶。在黑色素生物合成过程中,它首先将酪氨酸羟化产生L-多巴(邻位二羟基苯丙氨酸);然后再将L-多巴氧化成多巴醌,多巴醌经一系列复杂反应,最后形成黑色素。酪氨酸酶的研究,在1991年,Chen,Js.用实验证实曲酸主要通过干扰酪氨酸酶反应时所需要的氧来抑制黑色素的生成。2007年,王建新等人进行了酪氨酸酶抑制剂和激活剂的研究,表明酪氨酸酶是产生黑色素的主要限速酶,通过激活或抑制酪氨酸酶的活性可促进毛发和皮肤黑素的生成或抑制,达到乌发或皮肤增白的目的。2009年,何学民等人对黑色素与酪氨酸酶进行了研究,结果表明在体内黑色素生成过程中酪氨酸酶起了重要的催化作用,抑制酪氨酸酶活性便能达到减少色素生成的目的。在双峰驼中,酪氨酸酶是骆驼黑素细胞中重要的蛋白,具有催化活性,又是多种物质及生物的受体,与生物医学有着密切的关系。因此,对骆驼酪氨酸酶的研究将有助于细胞生物学和医学的发展。
技术实现思路
本专利技术提供了一种双峰驼酪氨酸酶双峰驼酪氨酸酶,该酶与体内黑素细胞密切相关,其氨基酸序列如下述(a)或(b)所示(a) SEQ ID NO. 2 所示序列;(b)在(a)限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或/和叠加一个或多个氨基酸衍生得到的,且与(a)编码蛋白质具有相同功能的保守性变异多肽、活性片段或活性衍生物的氨基酸序列。本专利技术还提供了一种双峰驼酪氨酸酶编码基因,其核苷酸序列如下述(a)或(b)所示(a) SEQ ID NO. I 所示序列;(b)由碱基简并或/和替代衍生的与(a)所述核苷酸序列90%以上同源性,且与(a)编码相同功能蛋白质的序列。本专利技术还提供了一种双峰驼酪氨酸酶编码基因的获取方法,该方法包括步骤(I)组织分离(Isolation) ; (2)总RNA的分离(Total RNA isolation):包括①提取RNA的准备工作组织总RNA提取组织总RNA的鉴定。(3)全长cDNA的克隆(Cloning ofFull-length cDNA)包括①引物设计及合成RT-PCR扩增;③克隆和测序,其中PCR引物的正向引物为SEQ ID NO. 3和反向引物为SEQ ID NO. 4, 其序列信息如下SEQ ID NO. 3 :5’ -ATGCTCCTGGCTGCTTTGTAC-3’,SEQ ID NO. 4 :Oligo dT。上述总RNA的分离是将双峰驼耳部组织液放入装有Trizol的匀浆器管中匀浆,离心分离,吸取上清液,在15-30°C温育5分钟,加氯仿,剧烈震荡,继续在15-30°C温育2_3分钟,再次离心分离,吸取上清液,加异丙醇混合均匀,后15-30°C温育10分钟,离心分离,所得沉淀物加75%乙醇洗涤,离心分离后自然干燥或真空干燥得到总RNA。分离提取后的总RNA用分光光度计测定RNA含量和用琼脂糖凝胶电泳分析RNA的质量。上述反转录PCR按照大连宝生物反转录试剂盒的要求进行反转录。上述克隆和测序包括PCR扩增片段的回收、回收片段同T载体的连接、质粒的转化、转化菌落的PCR鉴定与培养、质粒的回收、质粒的酶切鉴定和重组质粒的测序。上述PCR扩增片段的回收按照上海华舜小量胶回收试剂盒的要求进行。上述回收片段同T载体的连接用TaKaRa pMD18_T Vector试剂盒。上述质粒的转化为将感受态细胞加入到回收片段同T载体的连接产物中,冰浴30分钟,然后在42°C水浴热应激90秒钟,立即置入冰浴中2分钟,加液体LB培养基,37°C复活50分钟,后涂布于含有氨苄青霉的LB平板上,37°C恒温培养10-15小时。上述转化菌落的PCR鉴定与培养为挑选转化培养的单菌落,放入到加有PCR反应液的EP管中晃动,使单菌落充当模板;用获得该片段的PCR条件进行扩增,PCR产物同Marker 一起进行琼脂糖凝胶电泳,鉴别T载体上是否含有目的片段;若得到目的片段,可挑取在LB平板上的与之对应的单菌落,放入含有的青霉素钠LB液体培养基中,37°C过夜摇菌培养,用于质粒回收。上述质粒的回收用上海华舜小量质粒抽提纯化试剂盒实现。上述质粒的酶切鉴定采用双酶切法鉴定,选择内切酶Bam H I和Hin d III。本专利技术在提供了双峰驼酪氨酸酶基因的cDNA序列和蛋白编码序列基础上,将人、鼠、牛等不同物种酪氨酸酶基因的CDS序列和氨基酸序列进行同源性比较;对包括双峰驼在内的10个物种的十个酪氨酸酶基因的CDS序列构建了系统发生树。本专利技术中的双峰驼酪氨酸酶基因的cDNA序列是通过以双峰驼组织中总RNA为模板,参考人、鼠、牛等物种的酪氨酸酶基因的同源序列设计引物,进行反转录PCR而获得的新基因序列。获得的双峰驼酪氨酸酶基因cDNA序列见SEQ ID NO. I。将双峰驼酪氨酸酶基因cDNA序列中的编码序列(⑶S)按通用密码子翻译成的蛋白质编码序列见SEQ ID NO. 2。在SEQ ID NO. I中,RT-PCR产物长度为1806bp,电泳结果见图1,其中31-33位为起始密码子ATG,1621-1623位为终止密码子TAA,31-1623位为编码蛋白质区域(⑶S)。在SEQ ID NO. 1,双峰驼酪氨酸酶基因编码530个氨基酸。双峰驼与牛(AAL02331. 2)、绵羊(NP_001123499. I)的酪氨酸酶核酸序列具有89%的相似性。双峰驼和人、鼠、牛等动物用Clustal X中对齐的酪氨酸酶基因编码氨基酸序列同源性比较结果见图2。对包括SEQ ID NO. I在内的10个物种的十条酪氨酸酶基因的⑶S序列构建了系统发生树,结果发现双峰驼酪氨酸酶同牛和绵羊的进化距离最近,间接证明了所得到的序列确为双峰驼酪氨酸酶基因。本专利技术所得到的酪氨酸酶蛋白的基因序列和该蛋白结构的数据可用于研究其在黑素合成的下游途径中的重要作用,为阐明双峰驼毛色生成机理和未来产生人为控制的商用价值的毛色提供理论基础和依据,并能够为其它哺乳动物的皮肤与毛发色素形成机理研究奠定一定的生物学基础。附图说明图I为双峰驼酪氨酸酶基因RT-PCR产物电泳图; 图2为构建系统发生树所用酪氨酸酶氨基酸同源性比较;图3为不同物种酪氨酸酶氨基酸序列系统进化树。具体实施例方式下面实施例用于对本专利技术的进一步说明,但不用来限制本专利技术的保护范围。实施例I :双峰驼酪氨酸酶基因cDNA序列的克隆I.组织分离(Isolation)从内蒙古阿拉善盟双峰驼,快速采得样品,将耳部组织样迅速放入液氮中本文档来自技高网
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【技术保护点】
一种双峰驼酪氨酸酶,其氨基酸序列如下述(a)或(b)所示:(a)SEQ?ID?NO.2所示序列;(b)在(a)限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或/和叠加一个或多个氨基酸衍生得到的,且与(a)编码蛋白质具有相同功能的保守性变异多肽、活性片段或活性衍生物的氨基酸序列。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员:张文彬吉日木图
申请(专利权)人:张文彬
类型:发明
国别省市:

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