本发明专利技术公开了齐墩果酸在抗丙型肝炎病毒方面的一种新用途，即齐墩果酸在制备抗丙型肝炎病毒药物和试剂中的应用。齐墩果酸能显著抑制丙型肝炎病毒在细胞感染模型中的增殖，体外和细胞内活性抑制实验发现丙型肝炎病毒RNA依赖的RNA聚合酶NS5B是其作用的关键靶标。齐墩果酸广泛分布于植物界中,来源丰富,毒副作用小，齐墩果酸在细胞水平的抗HCVJFH1复制实验中的选择指数（CC50/IC50）超过目前使用的治疗药物ribavirin。因此,齐墩果酸的这种新用途可用于制备抗丙型肝炎病毒药物和试剂及其复制的聚合酶NS5B的抑制剂，具有重要的经济价值，医学价值和社会效益。本发明专利技术具有较好的HCV研究和治疗应用前景。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及抗病毒药物和试剂研发领域，尤其是涉及一种齐墩果酸在制备抗丙型肝炎病毒药物和试剂中的应用。
技术介绍
丙型肝炎病毒(Hepatitis C Virus, HCV)严重威胁全人类的健康,全球40%的慢性肝病和80%的肝细胞癌与HCV有关。目前没有预防HCV感染的疫苗，目前的标准化治疗方案是聚乙二醇干扰素和病毒唑(Ribavirin)的联合治疗，这种治疗仅对不足50%的感染者有效。2011年，美国食品和药物管理局批准了两种口服的HCV蛋白酶抑制剂boc印revirand telaprevir。这两种药物联合聚乙二醇干扰素和病毒唑能显著提高丙型肝炎患者的病毒清除率，但是，这些药物有副作用，而且对难治性丙型肝炎患者的治疗效果仍然不理想。 因此研发新的有效安全的特异性丙型肝炎治疗药物是国内外HCV基础研究和药物研发的热点和前沿。HCV基因组为正链RNA，属黄病毒科。HCV的开放阅读框编码一个3000多个氨基酸残基组成的多聚蛋白前体。该多聚蛋白前体经宿主蛋白酶和HCV编码的蛋白酶切割后产生病毒的结构蛋白(core、El和E2)和非结构蛋白(P7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B)。NS5B蛋白全长591个氨基酸，它具有RNA依赖的RNA聚合酶活性，是HCV复制的关键酶。NS5B的活性丧失会导致HCV在感染细胞内的复制停止。由于正常的宿主细胞不存在NS5B或其类似物的表达，抑制NS5B的活性可特异性地阻断HCV复制而不会对宿主细胞产生毒副作用，因此NS5B成为抗HCV药物筛选的一个非常理想的靶点。以NS5B为靶点进行抗HCV药物的研发已有诸多报道，但是由于安全性或有效性差等原因，尚没有一种以NS5B为靶点的抗HCV药物进入临床使用。中药女贞子长期以来作为肝保护剂药物使用。申请人前期构建了以HCV RNA为模板的NS5B活性检测系统，利用该活性检测系统，在国际上首次发现女贞子水提取物可显著抑制NS5B的体外和细胞内活性，揭示女贞子水抽提物有望成为抗HCV药物的来源。但是，女贞子水提取物的活性成分及其是否具有抗HCV活性仍然不清楚。女贞子主要含有三萜类化合物、黄酮类、裂环环烯醚萜类和对羟基苯乙醇苷类化合物以及多糖、氨基酸、脂肪酸、挥发油、色素、矿物质等多种化学成分。三萜类化合物在女贞子中的含量约为5. 61%，其中，齐墩果酸的含量较高。研究表明齐墩果酸可使变性坏死的肝组织恢复正常，还具有抗炎、抗人类免疫缺陷病毒(HIV)、抗突变和抗癌等作用。临床上齐墩果酸作为治疗急性黄疸性肝炎和慢性肝炎的药物。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供齐墩果酸的新用途，即齐墩果酸在制备抗丙型肝炎病毒药物和试剂中的应用，齐墩果酸能显著抑制HCV在细胞感染模型中的增殖，体外和细胞内活性抑制实验发现HCV RNA依赖的RNA聚合酶NS5B是其作用的关键靶标。本专利技术的目的是这样实现的 一、材料和方法 1、细胞和质粒 Huh-7. 5. I (美国 Francis V. Chisari 教授惠赠)，携带 HCVJFHl (基因型 2a)全基因组的质粒PJFHl (日本Takaji Wakita教授惠赠)，NS5B细胞内活性检测报告载体pcDNA- (-) Iuc- (-) IRES是通过把HCV正链5' UTR和荧光素酶基因反向连接至真核表达载体pcDNA3. I (-)获得。稳定表达NS5B的H印G2-5B细胞是通过稳定转染HCV基因型Ia的H株NS5B至H印G2细胞获得。HCV H和JFHl株的NS5B基因表达载体是通过把全长的NS5B基因或C端删去21氨基酸的NS5B Λ 21基因(确保蛋白在Escherichia coli BL21(DE3)表达的可溶性)分别克隆至真核表达载体pcDNA3. I ()或原核表达载体pET - His获得。NS5B基因克隆所用引物如表I所示。 H表I本骚究使用的引翁-——SB................................................................................................................. ￥衝丽:.........................................................................................................；H株KS3引物，. 碑.W.m! ； GCSOKMCCTtAAWTCTttTACCrGG 赞负.向引狻AA丁ATCCTAGC+SCGCWCCOKGCATGAGA , 博会#·正向引物5r "CCTCuArrATGGGTTrAATGTCTTATACETGG--S『HΓι*5·&·· 负问引物:Bi -CTTCA(IGOTGGGGAGG-3x --JFUl 株 NS5E-引IKLH ,,crrBl.^IH向引物5·' -'CCAKC-&TC J €CTCCATCTCATACTCCTGiMr.y .JfHx ·&οη_ -Λτ, χ. - 反向· Ι物5 - MT &MrrCTC ro WTCKC-rcaK · !..JPH 全长 . IBt Ittl t -ATCWCTWOTOTCATWJKirrosΛ -C ., '反向引物- MTtfSATCCTCKCa^CeCCCACTiwiflMC -3* .P:卜PCR引物.u , .￡. Ρ,Λ iE向引勸CACTaXCTGT+SAGGMCTACTGT;-Hw-s-pecifac Iili- e-, 反( <51 : TuCAtL-CTCTAv GAGA^CTUrf & 物 .正fi 引物GMGGTC-MGGTCGGAGTC,-GAPDh ☆物.. g pi 引物GMCATC-CTGATGGGATnC-.-^ 2、女贞子水提取物的制备和分离 女贞子(购于江西南华医药有限公司)溶入双蒸水(50g/1000mL)，放进冰箱4° C过夜。使用功率可调控电炉，先大火煮沸，然后小火煎熬2小时。取煎熬的上清，过滤除去残余的水不溶性残渣。过滤后的上清用乙酸乙酯萃取5次，乙酸乙酯层用硅胶薄层层析板层析，展开剂为三氯甲烷甲醇=18.5:1.5 (v/v)0使用乙酸乙酯收集5个层析组分(命名为组分1-5，附图说明图1)，冻干，-70° C冰箱保存备用。实验时，每种冻干组分溶入含2% 二甲基亚砜(DMSO)的DMEM培养基。3、其它试剂 齐墩果酸、熊果酸和红景天苷购于中国食品药品检定研究院。女贞苷和榭皮素购于成都曼思特生物科技有限公司。这些标准品的纯度> 98%。口服的齐墩果酸片购于九芝堂股份有限公司(国药准字H50020241，齐墩果酸净含量 26 %)，口服的熊果酸胶囊购于三九医药贸易有限公司(国药准字Z20000115，熊果酸净含量^ 11 %)，病毒唑(Ribavirin)购于Sigma-Aldrich0 HCV NS5B 抑制剂 2’-O-Me-CTP 购于 Tri I ink。HCV NS3/4A 蛋白酶抑制剂ITMN-191和MK-7本文档来自技高网...
【技术保护点】
齐墩果酸在制备抗丙型肝炎病毒药物中的应用。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：孔令保，李珊珊，孙瑞娜，吴晓玉，汪俊，
申请(专利权)人：江西农业大学，
类型：发明
国别省市：
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