本发明专利技术涉及红花玉兰组织培养快速繁殖方法，提供一种红花玉兰变种愈伤组织诱导的方法。选取红花玉兰变种带芽茎段作为最佳外植体，建立其最优灭菌消毒体系和培养基，筛选出最优的初代培养基和抑制褐化体系，诱导出红花玉兰变种的愈伤组织，为红花玉兰变种无性繁殖体系的建立奠定了基础，对其科研、绿化和观赏等应用价值的开发具有重要意义。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术是涉及一种组织培养愈伤组织诱导的方法，更具体的说涉及一种红花玉兰变种的愈伤组织诱导的方法。2.技术背景红花玉兰变种是木兰科木兰属玉兰亚属中的一新发现树种，系属湖北省五峰县红花玉兰变种野生类群之一，主要分布在五峰土家族自治县境内，分布区域较为狭窄。红花玉兰变种树种的性状较为独特，与一般的玉兰属树种相比，它的树形高大，多为15-20m的高大乔木，花瓣为9瓣，内外均为红色，色彩纯正艳丽，无论是远观还是近看都极具观赏价值。红花玉兰变种的发现对整个木兰科植物的区系分类和系统发育等问题具有一定的学术意义，为研究生物多样性提供了佐证，并且以极高的观赏价值为依托，在道路和城市绿化方面具有极大的开发和应用价值。红花玉兰变种是鄂西南特有树种，数量稀缺，分布范围狭窄，目前仅发现在湖北五峰中西部一片狭域的地带，种群面临灭绝危险，此外，由 于当地缺少有效的资源管理与保护措施以及人们对珍惜资源保护意识的淡薄，在利益的驱动下，一部分的红花玉兰大树已被砍伐和倒卖，种质资源流失严重。自然状态下红花玉兰变种林下幼苗稀少，更新困难，种子发芽率和保存率都较低。因此，对红花玉兰变种无性繁殖的研究不仅可以进行工厂化的生产育苗，提高红花玉兰变种的繁殖效率，降低生产成本，而且还可以筛选出有优良性状的无性系，满足生产、观赏所需，对红花玉兰变种科研、应用价值的开发具有重要意义。3.
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种红花玉兰变种愈伤组织诱导的方法。分别以红花玉兰变种的种子、腋芽、带腋芽茎段和叶片为外植体供试材料接种于MS培养基上，选择出最优的外植体类型和取材时间，再以此类型为外植体筛选出其最优灭菌消毒体系、最佳基本培养基和碳源，最优初代培养基、抑制褐化体系和诱导愈伤组织培养基。本专利技术提出的包括下述步骤(I)最优外植体的选择分别将剥去外种皮的种子、腋芽、带腋芽茎段和叶片用清水和毛刷进行外部清沽,然后再用20%的滴露消毒液浸泡30min后,置于流动水中冲洗Ih,完成初步灭菌工作。再将上述材料置于超净工作台中进行进一步的消毒处理(75%酒精30S，10% NaClO IOmin)和剪切处理，种子一般保留全部体积1/3左右的带胚部分，腋芽和带芽茎段重新切口，叶片一般取自带中脉的的正方形部分，将处理后的实验材料接种于MS+lmg · Ll-BA+lmg · T1NAA基本培养基上正常培养。(2)外植体最优取材时间的选择2009年5月-10月的各月中旬，选择晴朗无风的天气，于正午12点- 13点获取最佳的外植体类型，接种于上述(I)培养基中正常培养。(3)最优灭菌体系的建立取健壮的带芽茎段30个置于流动水中冲洗O. 5h，然后将其浸泡在20% “滴露”消毒液中15min，再用流动水冲洗lh，然后在超净工作台中用75%酒精进行30S的初步灭菌，分别以似(10浓度5%、10%、15%、20%和灭菌时间lOmin，、20min，、30min进行12完全随机组合处理。最后将外植体接种于上述(I)MS基本培养基中正常培养。(4)基本培养基及其碳源的选择将经过(3)步骤灭菌后的无菌外植体接种到一个1^(34)培养基实验设计中正常培养，3个因素分别为基本培养基(MS、1/2MS、WPM)，碳源种类(果糖、鹿糖、白砂糖)，碳源浓度(15g、30g、40g)。(5)抑制褐化体系建立对红花玉兰变种的外植体进行冷处理和浸泡聚乙烯吡咯烷铜(PVP)溶液处理，具体方法如下①将采回的嫩枝用湿沙布包好外植体的切口部分放在4°C下冷藏2h、4h后，切成茎段进行灭菌处理。②将带芽茎段在灭菌前放在lg/Lg -L-I的聚乙烯吡咯烷铜(PVP)溶液中浸泡lh、2h。③灭菌后的带芽茎段在上述PVP的溶液中切割，接种。将红花玉兰变种外植体接种在添加了二硫苏糖醇(O.Smg·!/1)、抗坏血酸 Vc (5mg · Γ1)和活性炭(2g · Γ1)的培养基上正常培养，通过改变培养条件，控制外植体的褐变，具体方式如下①遮光处理。在25°C下暗培养15天后转入光下培养。②低温遮光处理。在15°C条件下遮光15天后转入25°C的全光照下培养。(6)初代培养体系的建立将经过前期外植体处理和灭菌后的带芽茎段接种到添加了植物生长调节剂(细胞分裂素6-BA，生长素萘乙酸NAA)、吸附剂(AC)和抑制剂(Vc)的MS初代培养基上正常培养。(7)愈伤组织的诱导将经过初代培养的组培苗接种到不同含量的植物生长调节剂(细胞分裂素6-BA，KT,生长素NAA)诱导愈伤组织培养基中正常培养。上述步骤中正常培养的条件为室温25±2°C，空气相对湿度60%左右，光照强度为2000-30001x，光周期为光培养16h、暗培养8h。附图说明 图I不同时间取材对带芽茎段褐化率和成活率的影响 5.具体实施例方式以下实施例用于说明本专利技术，但不用来限制本专利技术的范围。实施例I.最佳外植体的选择将灭菌的红花玉兰变种种胚、叶片、叶芽和带芽茎段外植体分别接种于上MS培养基上培养(表I)，带芽茎段的成活率和萌动率较高，分别为80. 3^^75.6%,叶片、种胚、腋芽的成活率和萌动率均较低，分别为2 %，3 %，10. 6 %和O %，I. 3 %，5. 3 %。方差分析可知，带芽茎段与其他三种外植体类型差异显著，是红花玉兰变种组织培养外植体最佳类型。通过对带芽茎段采集时间与褐化率关系分析可知，秋季9、10月份采集，外植体褐化现象减弱，通过成活率比较可知，9月份取材的成活率要高于10月份取材10%左右，因此，9月份取材可作为红花玉兰外植体最佳的取材时间。表I不同种外植体的生长情况比较)权利要求1.一种红花玉兰变种愈伤组织诱导的方法，其特征在于包括以下步骤分别以红花玉兰变种的种子、腋芽、带腋芽茎段和叶片为外植体供试材料接种于MS培养基上，选择出最优的外植体类型和取材时间，再以此类型为外植体筛选出其最优灭菌消毒体系、最佳基本培养基和碳源，最优初代培养基、抑制褐化体系和诱导愈伤组织培养基。2.根据权利要求I所述的愈伤组织诱导方法，其特征在于，所述红花玉兰变种愈伤组织诱导的最佳外植体为带芽茎段，最优取材时间为9月份。3.根据权利要求I所述的愈伤组织诱导方法，其特征在于，所述红花玉兰变种最优消毒灭菌体系为以带芽茎段为外植体，用75%酒精浸泡外植体30s后无菌水冲洗3-4次，然后以10% NaClO液浸泡IOmin再以无菌水冲洗4次。4.根据权利要求I所述的愈伤组织诱导方法，其特征在于，所述红花玉兰变种最佳基本培养基为MS培养基,最佳碳源为30g. L—1的鹿糖。5.根据权利要求I所述的愈伤组织诱导方法，其特征在于，以下三种方法均可有效地抑制红花玉兰变种褐化 (1)在接种前将枝条浸在PVP溶液中切割或冷藏枝条4h； (2)向培养基中添加5mg.Γ1的抗坏血酸或2g. Γ1的活性炭； (3)在15°C条件下遮光培养15天后转入25°C的全光照下培养。6.根据权利要求I所述的愈伤组织诱导方法，其特征在于，所述红花玉兰变种组织培养最优初代培养基为MS+6-BA 2. Omg. L_1+NAA I. 5mg. L_1+VC 5mg. L_1L+AC 3mg. L'7.根据权利要求I所述的愈伤组织诱导方法，其特征在于，所述红花玉兰变种组织培养最优愈伤组本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种红花玉兰变种愈伤组织诱导的方法，其特征在于包括以下步骤：分别以红花玉兰变种的种子、腋芽、带腋芽茎段和叶片为外植体供试材料接种于MS培养基上，选择出最优的外植体类型和取材时间，再以此类型为外植体筛选出其最优灭菌消毒体系、最佳基本培养基和碳源，最优初代培养基、抑制褐化体系和诱导愈伤组织培养基。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：马履一，怀慧明，贾忠奎，
申请(专利权)人：北京林业大学，
类型：发明
国别省市：
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