本发明专利技术提供一种聚乙二醇化重组人粒细胞集落刺激因子的纯化方法，本发明专利技术的发明专利技术人对各种层析方法进行了大量的研究，发现利用脱盐层析、离子交换串联层析和脱盐层析顺序组合纯化，能够获得高纯度的聚乙二醇化重组人粒细胞集落刺激因子。本发明专利技术纯化工艺充分利用了目的蛋白在表面电荷和疏水性上的特点，先通过一个阴离子交换层析柱，有效的去除了内毒素，增加了工艺的可控性；第二步层析充分利用目的蛋白的强疏水性，实现了串联层析，将内毒素的去除和蛋白的纯化两个步骤合并为一个步骤。本工艺不仅可以有效去除内毒素，并且简化了操作步骤，节省了生产时间，提高了生产效率，十分适合大规模工业化放大生产。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及利用重组DNA技术生产基因工程药物的方法，具体涉及聚こニ醇化重组人粒细胞集落刺激因子(PEG-rhG-CSF或PEG-G-CSF)的纯化方法，属于医药
技术介绍
粒细胞集落刺激因子(G-CSF)是造血因子之一，由175个氨基酸组成，是ー种水溶性的蛋白，具有疏水性。它的主要作用是刺激中性粒细胞系造血细胞的増殖、分化，増加外周血中性粒细胞数量，活化中性粒细胞功能，在预防和治疗多因素引起的中性粒细胞減少症及其并发症(如发热、感染等)方面疗效显著。1991年，Amgen(安姆根)公司的重组人粒细胞集落刺激因子(rhG-CSF)被FDA批准上市用于化疗引起的中性粒细胞减少症的治疗。但作为ー种生物大分子药物，rhG-CSF像大多数生物制品一祥，在临床应用中存在体内半衰期短，易被酶水解和肾脏清除等问题。在化疗过程中，需要长达两周的持续每日静脉或 皮下注射，造成病人依从性较差。聚こニ醇(PEG)修饰是实现蛋白质药物长效的ー种应用较为广泛的方法，PEG修饰的蛋白质和多肽类药物半衰期明显延长，溶解度和稳定性得到改善，免疫原性降低，生物利用度增强，毒副作用減少。PEG修饰的rhG-CSF实现了长效增加外周血中性粒细胞数的目的，2002年，FDA又批准了 Amgen公司的聚こニ醇化粒细胞集落刺激因子(PEG-G-CSF)上市，商品名Neulasta。PEG-G-CSF是由单甲氧基聚こニ醇丁醛与大肠杆菌表达纯化的蛋氨酰化的粒细胞集落刺激因子N-末端赖氨酸氨基共价连接而成，与G-CSF相比其在体内的半衰期明显延长，因而可以減少治疗时的注射次数，減少病人的痛苦。在PEG-G-CSF的纯化过程中，需要去除PEG与G-CSF交联反应液中的交联剂、ニ交联的G-CSF及未交联的G-CSF等。由于交联产生的多种不同交联蛋白异构体，除了分子量有所区别外，其他性质如表面电荷、疏水性等差别较小，因此，分离纯化交联蛋白产物，成为聚こニ醇化技术的难点之一。安姆根公司在专利CN1071760C中公开了 N-末端PEG化rh-G-CSF的纯化方法,将交联反应混合物上样于阳离子交换层析柱Sepharose FF柱，以醋酸钠缓冲液平衡后进行线性洗脱，收集洗脱液；将洗脱液再进行分子筛层析的方法来纯化。虽然，分子筛层析能够去除分离各种交联异构体，但是由于分子筛很难在エ业中实现放大，因此国内大多数的纯化方法是根据表面电荷的差异，采用离子交換层析进行分离纯化，例如CN1663962A公开了 PEG-G-CSF的一步纯化方法，采用阳离子交换层析柱SP SepharoseF.F.装柱后用こ酸-こ酸钠缓冲液平衡，再用不同pH值的こ酸-こ酸钠缓冲液洗脱。此纯化工艺虽然可以实现エ业上的放大，但由于采用的是作用比较单ー的阳离子交換介质进行吸附-解析来进行分离，其内毒素很难控制，导致终产品中内毒素含量不容易控制，影响了产品的质量。
技术实现思路
本专利技术针对现有技术的不足，提供一种聚こニ醇化重组人粒细胞集落刺激因子的纯化方法，本专利技术的专利技术人对各种层析方法进行了大量的研究，发现利用脱盐层析、离子交换串联层析和脱盐层析顺序组合纯化，能够获得高纯度的聚こニ醇化重组人粒细胞集落刺激因子。本专利技术纯化工艺充分利用了目的蛋白在表面电荷和疏水性上的特点，先通过ー个阴离子交换层析柱，有效的去除了内毒素，増加了エ艺的可控性；第二步层析充分利用目的蛋白的强疏水性，实现了串联层析，将内毒素的去除和蛋白的纯化两个步骤合并为ー个步骤。本エ艺不仅可以有效去除内毒素，并且简化了操作步骤，节省了生产时间，提高了生产效率，十分适合大規模エ业化放大生产。实施本专利技术的前期步骤为现有技术可以采用CN1071760C中公开的方法来获得聚こニ醇化重组人粒细胞集落刺激因子交联液，将该交联液作为后续处理的对象。该方法主要步骤在于将经过脱盐后的聚こニ醇化重组人粒细胞集落刺激因子交联液顺次通过阴离子交换层析柱与多结合型离子交换层析柱串联层析系统，利用内毒素与阴离子交换层析柱的高度吸附作用达到去除内毒素的目的；之后采用添加了氯化钠的缓冲液単独对多结合型离子交换层析柱进行洗脱，收集洗脱后的目的蛋白液；更进一歩的，本专利技术的具体处理步骤如下(I)聚こニ醇化重组人粒细胞集落刺激因子交联液经过葡聚糖凝胶G-25 (Sephadex G-25)脱盐，得脱盐液；(2)脱盐液顺次通过阴离子交换层析柱与多结合型离子交换层析柱串联层析系统，使内毒素结合到阴离子交换层析柱上，至上样完毕；(3)采用添加了氯化钠的缓冲液単独对多结合型离子交换层析柱进行洗脱，收集洗脱后的目的蛋白液；(4)洗脱后的目的蛋白液经过葡聚糖凝胶G-25 (Sephadex G-25)脱盐柱脱盐去除Na+、Cl-,得到高纯度的蛋白样品。上述过程中，步骤(I)和(2)中的葡聚糖凝胶G-25脱盐层析柱和阴离子交换层析柱与多结合型离子交换层析柱串联层析洗脱在上样前均采用PH6. 0-8. 5，浓度为IOmmol/L lOOmmol/L的磷酸盐缓冲液进行平衡；其中优选采用pH7. 0-8. O、浓度为20mmol/L 50mmol/L的磷酸盐缓冲液进行平衡；步骤(2)中采用的阴离子交换层析柱的层析介质包括琼脂糖凝胶(S印harose)类、聚苯こ烯(SOURCE)类，配基为季氨基Q或ニこ基氨こ基DEAE ;优选层析介质为琼脂糖凝胶类，配基为季氨基Q或ニこ基氨こ基DEAE ;最优选的层析介质为琼脂糖凝胶类，配基为李氨基 Q (Sepharose Q Fast Flow)；步骤(2)中的多结合型离子交换层析柱的层析介质为高流速琼脂糖凝胶类、聚苯こ烯类或硅颗粒类，配基为带部分疏水基团的离子交換配基；其中优选配基为N-苯甲基-N-甲基こ醇胺、带疏水基团的季氨基和带疏水基团的磺酸基；最优选优选层析介质为高流速琼脂糖类，配基为N-苯甲基-N-甲基こ醇胺(Captro adhere)；这种多结合型离子交换层析介质相较于単一性质的分离层析介质，同时具有离子 交換功能基团和疏水作用功能基团，可以通过两种作用方式，将蛋白吸附在层析介质上，从而实现通过多种性质进行目的蛋白的纯化、分离。而步骤(2)中所述的脱盐液可以连续通过阴离子交换层析柱和多结合型离子交换层析柱串联层析系统；同样的步骤(2)中所述的脱盐液也可以首先通过阴离子交换层析柱之后收集，再集中通过多结合型离子交换层析柱。步骤(3)中所述的添加氯化钠的缓冲液为Tris-HCl或醋酸钠缓冲液，缓冲液pH为4. O 7. O,缓冲液浓度为10mmol/L 100mmol/L ;优选缓冲液浓度为20mmol/L 50mmol/L,而其中所添加氯化钠的缓冲液中氯化钠的浓度为100mmol/L I. Omol/L ;优选氯化钠的浓度为100mmol/L 600mmol/L。控制氯化钠的浓度可以使得缓冲液的离子强度发生变化，从而使吸附在阳离子交换层析柱上的目标蛋白解吸，达到了分离的目的。 所述步骤(4)中的葡聚糖凝胶G-25脱盐层析柱在上样前，需采用pH4. O的20mM的醋酸钠缓冲液进行平衡。采用这种技术后，通过采用合适的缓冲体系和层析介质，将两步层析进行了串联，简化了层析步骤，节省了层析时间和エ艺成本，并提高了エ艺的处理量。PEG-G-CSF本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种聚乙二醇化重组人粒细胞集落刺激因子的纯化方法，其特征在于：将经过脱盐后的聚乙二醇化重组人粒细胞集落刺激因子交联液顺次通过阴离子交换层析柱与多结合型离子交换层析柱串联层析系统，使内毒素结合到阴离子交换层析柱上；之后采用添加了氯化钠的缓冲液单独对多结合型离子交换层析柱进行洗脱，收集洗脱后的目的蛋白液；其中所述的步骤(2)中采用的阴离子交换层析柱的层析介质为琼脂糖凝胶类或聚苯乙烯类，配基为季氨基Q或二乙基氨乙基DEAE；所述的多结合型离子交换层析柱的层析介质为高流速琼脂糖凝胶类或聚苯乙烯类或硅颗粒类，其配基为带部分疏水基团的离子交换配基；所述的添加了氯化钠的缓冲液为Tris？HCl或醋酸钠缓冲液，缓冲液pH为4.0～7.0，缓冲液浓度为10mmol/L～100mmol/L；其中氯化钠浓度为0.1mol/L～1.0mol/L。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：王晶翼，孙丽霞，王克波，艾现伟，董婷，王希菊，张乐，王乐，
申请(专利权)人：齐鲁制药有限公司，
类型：发明
国别省市：
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