本发明专利技术公开了一种通过红姜花体细胞胚胎发生途径高效再生植株的方法。该方法以红姜花未成熟的花丝和花药为外植体进行愈伤组织的诱导，经过优化、筛选、继代培养获得高质量的胚性愈伤组织，将胚性愈伤组织进行悬浮培养，建立红姜花的胚性细胞悬浮培养系。利用胚性细胞悬浮培养物进行体胚诱导可获得大量体胚，采用SH无机盐、150μg·L-1TDZ时可获得最佳效果，其体胚发生频率可达到4429个/mL?SCV；所获得的体胚在体胚萌发培养基上可萌发出带有芽、根的幼苗，当以SH为基本培养基、6-BA为0.5～1.0mg·L-1时，体胚的萌发频率可达100%。本发明专利技术为红姜花的离体快速繁殖和生物技术育种奠定基础，有利于大规模的推广应用，具有较好的应用前景。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于姜科(Zingiberaceae)姜花属(Hedychium)生物技术育种领域，特别涉及一种通过红姜花(Hedychium coccineum Buch.-Ham)体细胞胚胎发生途径高效再生植株的方法。通过该方法能够建立红姜花胚性细胞悬浮培养系(embryogenic cellsuspensions, ECS),以及从胚性细胞悬浮培养系获得高效的体细胞胚胎发生频率，成功建立高效的植株再生体系。
技术介绍
红姜花(Hedychiumcoccineum Buch.-Ham)为姜科姜花属(Hedychium)多年生草本植物，分布于我国西藏、云南和广西一带，沿喜马拉雅诸国及斯里兰卡、緬甸及越南也有分布。红姜花是姜花属中的珍品，观赏价值极高，鲜红色的穗状花序，宜做高档鲜切花或园林绿化使用；红姜花的花红色艳丽、花型美丽，似群蝶飞舞，也是极好的花卉育种材料。但红 姜花主要通过无性分株进行繁殖，分生能力弱，自然状态下繁殖系数低，不耐移植，远远不能满足大规模生产的需要；红姜花鲜切花插花期只有3 5天，植株高达2米，也限制了其作为观赏花卉的商业价值。因此，提高红姜花繁殖系数、培育鲜切花瓶插期长、矮化的红姜花新品种是加快红姜花农业生产规模化和品种改良的有效措施。包括离体快繁技术、体外诱变、转基因、体细胞杂交等生物技术方式是进行红姜花大规模快繁和进行品种改良的有效手段。建立稳定的红姜花胚性细胞悬浮培养系及经体胚发生途径的高效的植株再生体系则是实现红姜花生物技术育种的有效前提条件。目前还没有关于红姜花ECS的建立以及通过ECS进行高频体胚发生再生植株的报道。专利技术内容本专利技术的目的在于提供一种通过红姜花体细胞胚胎(体胚)发生途径高效再生植株的方法。该方法首次建立红姜花的胚性细胞悬浮培养系，并提供一种通过体细胞胚胎发生途径高效再生植株的方法，为红姜花的离体快速繁殖和生物技术育种奠定基础。本专利技术的目的通过下述方案实现，包括如下步骤(I)愈伤组织的诱导和胚性愈伤组织的优化增殖以红姜花未成熟的花丝和/或花药为外植体，接种于愈伤组织诱导培养基上诱导培养出愈伤组织；将诱导出的愈伤组织继代培养在愈伤组织优化与增殖培养基上，得到黄白色粉状的胚性愈伤组织；(2)均一稳定的胚性细胞悬浮培养系的建立将步骤(I)的黄白色粉状的胚性愈伤组织O. 5 2. Og转入液体培养基中，置于90 IlOrpm摇床上悬浮培养I 2个月，得到分散、均质的胚性细胞悬浮培养系；(3)体细胞胚胎的诱导取步骤(2)得到的胚性细胞悬浮培养系，调整细胞密度为10%SCV悬浮培养物(settled cell volume，简称SCV，是指悬浮细胞静置后所得的细胞沉淀体积)，取0. 5 2. OmL 10%SCV悬浮培养物接种于体胚诱导培养基中，置于28±1°C黑暗中进行体细胞胚胎诱导，得到成熟体细胞胚胎；(4)体细胞胚胎的萌发及其植株再生将步骤(3)诱导出的成熟体细胞胚胎转入体胚萌发培养基中，置于28土 1°C黑暗培养，待叶鞘抽出后，将其转至生根壮苗培养基中继续培养，进一步发育成健壮的红姜花再生小植株；步骤(I)中所述的红姜花优选为6月中旬到7月中旬的红姜花未成熟的花序小花；所述的花序小花优选采用以下方法进行前处理取红姜花未成熟的花序小花，用自来水冲洗30min,然后用O. lwt%HgCl2消毒8 12min,用无菌水冲洗4 6遍,剥除外部苞片，切取花药和/或花丝备用； 所述的愈伤组织诱导培养基的组成为MS培养基+ (2 4)mg -1^2, 4-D (2，4_ 二氯苯氧乙酸)+ (2 4) mg · T1NAA (萘乙酸)+Img · Ll-BA (6-苄基腺嘌呤)+30g · Γ1蔗糖+7g · Γ1琼脂粉，pH 5.8,高温高压灭菌；优选的，所述的愈伤组织诱导培养基的组成为MS培养基+4mg -1^2, 4_D+4mg -L^1NAA+Img · L—VBA+SOg · L-1 蔗糖 +7g · L-1 琼脂粉，pH 5. 8，高温高压灭菌；所述的诱导培养优选于28±1°C黑暗条件下培养4个月；所述的愈伤组织优化与增殖培养基的组成为MS培养基+ (I 2) mg · 1^2，4-D+(O. 25 l)mg · L 1NAA+ (O. 25 l)mg · L ^-BA+SOg · L 1 鹿糖 +7g · L 1 琼脂粉，pH 5. 8，高温高压灭菌；优选的，所述的愈伤组织优化与增殖培养基的组成为MS培养基+Img -1^2, 4-D+0 25mg · L_1NAA+0. 25mg · L_16-BA+30g · L-1 鹿糖 +7g · L-1 琼脂粉，pH 5. 8,高温高压灭菌；所述的高温高压灭菌的条件优选为在121°C、1. 06kg/cm2灭菌15min ；所述的继代培养的时间优选为2 4个月；步骤(2)中所述的液体培养基的组成为MS培养基的无机盐+IOOmg · L—1麦芽水解物+IOOmg · L 1 谷氛酸胺 +230mg · L 1 脑氛酸 + (O. 02 O. 25) mg · L 1NAA+ (O. 5 I)mg · U12, 4-D+B5 培养基的维生素(Gamborg et al, 1968) +45g · L-1 鹿糖，pH 5. 3,高温高压灭菌；优选的，所述的液体培养基的组成为MS培养基的无机盐+IOOmg -T1麦芽水解物+IOOmg · L-1 谷氨酰胺 +230mg · L-1 脯氨酸 +0. 02mg · L^1NAA+Img · U12, 4_D+B5 培养基的维生素+45g · L—1鹿糖，pH 5. 3,高温高压灭菌；所述的高温高压灭菌的条件优选为在121°C、1. 06kg/cm2灭菌15min ；所述的液体培养基的体积优选为30mL ；所述的悬浮培养的温度优选为28± 1°C ；所述的悬浮培养I 2个月优选采用以下方法进行在培养的第一个月每周吸弃2/3的旧培养液，用等体积的新鲜的液体培养基补充，同时用900 μ m孔径筛网过滤除去不易分散的大颗粒，其后每2周更换一次培养基，再继代一个月后，得到分散、均质的红姜花胚性细胞悬浮培养系；步骤(3)中所述的10%SCV悬浮培养物优选按下述方法制备得到吸取步骤(2)得到的胚性细胞悬浮培养系于IOmL刻度管中，静置，直到获得细胞沉淀lmL，弃上清液，将所得的细胞沉淀用不含琼脂粉的体胚诱导培养基稀释至总体积10mL，得10%SCV悬浮培养物，此时细胞体积含量为总体积的10% ；所述的胚性细胞悬浮培养系的体积视胚性细胞悬浮培养系中的细胞浓度而定，只要获得细胞沉淀ImL即可；所述的红姜花细胞接种量优选为O. 5 2. OmL 10%SCV悬浮培养物；所述的红姜花细胞接种量更优选为I. OmL 10%SCV悬浮培养物；所述的体胚诱导培养基的组成为SH培养基(Schenk和Hildebrandt, 1972)的无机盐+IOOmg · L-1麦芽提取物+IOOmg · L-1谷氨酰胺+230mg · L-1脯氨酸+ (O. 02 O. 25)mg · T1NAA+ (50 250) μ g · T1TDZ (N-苯基-N-1, 2，3-噻二唑 ~5~ 脲)+B本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种通过红姜花体细胞胚胎发生途径高效再生植株的方法，其特征在于包括如下步骤：（1）愈伤组织的诱导和胚性愈伤组织的优化增殖：以红姜花未成熟的花丝和/或花药为外植体，接种于愈伤组织诱导培养基上诱导培养出愈伤组织；将诱导出的愈伤组织继代培养在愈伤组织优化与增殖培养基上，得到黄白色粉状的胚性愈伤组织；（2）均一稳定的胚性细胞悬浮培养系的建立：将步骤（1）的黄白色粉状的胚性愈伤组织0.5～2.0g转入液体培养基中，置于90～110rpm摇床上悬浮培养1～2个月，得到分散、均质的胚性细胞悬浮培养系；（3）体细胞胚胎的诱导：取步骤（2）得到的胚性细胞悬浮培养系，调整细胞密度为10%SCV悬浮培养物，取0.5～2.0mL？10%SCV悬浮培养物接种于体胚诱导培养基中，置于28±1℃黑暗中进行体细胞胚胎诱导，得到成熟体细胞胚胎；（4）体细胞胚胎的萌发及其植株再生：将步骤（3）诱导出的成熟体细胞胚胎转入体胚萌发培养基中，置于28±1℃黑暗培养，待叶鞘抽出后，将其转至生根壮苗培养基中继续培养，进一步发育成健壮的红姜花再生小植株；所述的愈伤组织诱导培养基的组成为：MS培养基+（2～4）mg·L？12,4？D+（2～4）mg·L？1NAA+1mg·L？16？BA+30g·L？1蔗糖+7g·L？1琼脂粉，pH？5.8，高温高压灭菌；所述的愈伤组织优化与增殖培养基的组成为：MS培养基+（1～2）mg·L？12,4？D+（0.25～1）mg·L？1NAA+（0.25～1）mg·L？16？BA+30g·L？1蔗糖+7g·L？1琼脂粉，pH？5.8，高温高压灭菌；所述的液体培养基的组成为：MS培养基的无机盐+100mg·L？1麦芽水解物+100mg·L？1谷氨酰胺+230mg·L？1脯氨酸+（0.02～0.25）mg·L？1NAA+（0.5～1）mg·L？12,4？D+B5培养基的维生素+45g·L？1蔗糖，pH？5.3，高温高压灭菌。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：肖望，涂红艳，邓崇会，陈爱葵，
申请(专利权)人：广东第二师范学院，
类型：发明
国别省市：
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