本发明专利技术公开了一种甘精胰岛素及其类似物的制备方法，该方法包括如下步骤：(1)利用基因工程方法制备B链C端含多个碱性氨基酸的甘精胰岛素及其类似物的前体；(2)利用氨基酸侧链保护剂使胰酶特异性识别精氨酸或赖氨酸，在保护剂、胰酶的作用下获得带保护基团的甘精胰岛素及其类似物；或者不保护直接使用特异作用于Arg的梭菌蛋白酶或特异作用于Lys的胞内蛋白酶Lys?C；(3)任选地通过加入羧肽酶而脱除C末端未保护的碱性氨基酸；(4)脱保护得到甘精胰岛素及其类似物。本发明专利技术的制备方法更为简便，得率高，而且应用范围更广，适用于两个以上的碱性氨基酸的引入。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及了，具体地讲，本专利技术涉及一种利用基因工程制备重组的甘精胰岛素及其类似物的前体、并将前体该转化成为甘精胰岛素及其类似物的方法，此类类似物的主要结构特征在于C末端含多个碱性氨基酸。
技术介绍
甘精胰岛素是将人胰岛素A链上天然排列在第21位的天门冬酰胺(Asn)置换为甘氨酸(Gly);在B链第30位的苏氨酸(Thr)上添加2个精氨酸(Arg)而合成的人胰岛素类似物。精氨酸的加入使这种胰岛素分子表面增加了正电荷，等电点从5. 4上升到6. 7，使甘精胰岛素在弱酸环境中呈无色透明溶液状，而在接近中性的生理条件下溶解度降低，溶液出现沉淀而呈浑浊状。甘精胰岛素经皮下注射后，分子会立即聚合，并在皮下形成甘精胰 岛素的沉淀物，延缓溶解和吸收的时间，起到长效的作用。而将人胰岛素A21位上的天门冬酰胺置换成甘氨酸，增加了甘精胰岛素在弱酸环境中的稳定性，提高了制剂的稳定性。现有的研究表明，甘精胰岛素每日只需皮下注射一次，作用可以持续24小时，且无明显峰值，可以较好的模拟正常基础胰岛素的分泌。甘精胰岛素在疗效相近的基础上比中性精蛋白锌(NPH)胰岛素有更低的低血糖发生率。甘精胰岛素的制备方法与胰岛素类似，可采用基因工程技术先制备前体，再经过转肽制备成品。其中，前体的制备方法仅需在胰岛素原的基础上将表达的氨基酸序列进行相应的改动，可以使用同样的表达载体及宿主菌，比较经典的工艺为Eli Lilly的工艺US4，430，266、Novo 的工艺 US 4，916，212、Sanof i (Hoechst)的工艺 US 5，663，291 ;而转肽的方法则由于末端两个精氨酸的引入而与胰岛素的工艺不同，在Sanofi-Aventis的专利申请(US 2009/0192073 Al)中，采用先制备Arg(B31)Arg(B32)Gly(A21)胰岛素前体，用胰酶转肽后得Arg(B31)Arg(B32)Gly (A21)胰岛素及Arg(B31)Gly (A21)胰岛素两种结构，分离后前者为甘精胰岛素，后者在酸性条件下胰酶的作用下加入带保护基团的Arg，最后脱保护得甘精胰岛素及其类似物。这种方法的缺点在于前体转肽后形成的两种结构理论得率为各50%，且结构较为一致，分离得率低。引入保护基团的Arg的反应条件均为偏酸性12°C左右(需制冷)，得率偏低，在其实施例中加保护基团的Arg的得率报道为> 60%。而且，US2009/0192073使用含保护基团的碱性氨基酸，成本过高。
技术实现思路
本专利技术的目的提供。在本专利技术的制备方法中避免使用含保护基团的碱性氨基酸，从而降低了成本；而且，该方法同时避免了制备过程中形成两种不同结构的Arg(B31)Arg(B32)Gly (A21)胰岛素和Arg (B31) Gly (A21)胰岛素，从而简化了分离步骤，提高了产物收率。一方面，为实现本专利技术的专利技术目的，本专利技术提供了，该方法包括如下步骤(I)利用基因工程方法制备B链C端含多个碱性氨基酸的甘精胰岛素及其类似物的前体；(2)利用氨基酸侧链保护剂使胰酶特异性识别精氨酸或赖氨酸，在保护剂、胰酶的作用下获得带保护基团的甘精胰岛素及其类似物；或者不保护直接使用特异作用于Arg的梭菌蛋白酶或特异作用于Lys的胞内蛋白酶Lys C ；(3)任选地通过加入羧肽酶而脱除C末端未保护的碱性氨基酸；(4)脱保护得到甘精胰岛素及其类似物。 上述的制备方法中，甘精胰岛素及其类似物优选为通式I所表示的、具有A链和B链的物质A 链=Gly-AS-ASO-R1B 链Phe-B2-B29- (R2) m_ (R3) η(通式I)其中，在上述通式I的Α、Β链间及链内二硫键的位置同人胰岛素或动物源胰岛素；Α2-Α20.Β2-Β29表示与人胰岛素或动物源胰岛素相同的氨基酸残基，Α2-Α20对应于人胰岛素、动物胰岛素或胰岛素类似物的A链序列，Β2-Β29对应于人胰岛素、动物胰岛素或胰岛素类似物的B链序列；R1是Asn、Ser和Gly残基中的一个；R2和R3分别是Arg残基、Lys残基中的一种,其中，如果R2是Arg残基,则R3是Lys残基；如果R2是Lys残基，则R3是Arg残基；m是1-4之间的整数；η是O或I。在上述制备方法的步骤(2)中，氨基酸侧链保护剂是指精氨酸或赖氨酸的保护齐U，这类保护剂能可逆地与精氨酸或赖氨酸残基反应。例如，对链内的Lys进行保护时，可使用酸酐类保护剂如琥珀酸酐、柠康酐等(此处可以多列举其它的保护剂)。在上述制备方法的步骤(3)中，脱保护包括调节pH、通过透析或柱上脱保护。另一方面，为实现本专利技术的专利技术目的，本专利技术还提供了一种如通式I所表示的甘精胰岛素及其类似物。再一方面，为实现本专利技术的专利技术目的，本专利技术还提供了一种甘精胰岛素及其类似物的前体，其中，该前体含有通式I的A链及B链的一段氨基酸序列，而且，B链与A链之间有连接肽，该前体序列中η = I。优选地，上述前体中的连接肽是包括C肽、小C肽在内的各种连接肽，该连接肽的特点在于C末端为通式I中的R3。优选地，B链N端可融合有未切掉的信号肽序列、有助于复性的分子伴侣序列或其它连接肽序列，该连接肽的特点在于C末端为通式I中的R3。根据本专利技术，在前体结构上稍作改动就能应用于C末端2个以上碱性氨基酸的甘精胰岛素及其类似物的生产中，应用范围广。胰酶酶切识别为点为碱性氨基酸的C末端，因而在使用胰酶直接酶转时，只能直接获得C端带一个碱性氨基酸的肽链，本专利技术的技术特点在于对碱性氨基酸Lys和Arg其中的一种进行保护修饰，使胰酶只作用于没有保护的另外一种碱性氨基酸，从而可得到如通式I中表示的C端带多个碱性氨基酸的肽链。本专利技术提供的制备甘精胰岛素及其类似物的方法更为简便，得率高，而且应用范围更广，适用于两个以上的碱性氨基酸的引入。US2009/0192073 Al中所报道的两个碱性氨基酸的得率为>60%，按该申请的技术路线，可以推算如果要引入三个碱性氨基酸，可以保证的得率仅为> 36%。下面结合附图和具体实施方式，进一步阐述本专利技术。应理解，这些实施例仅用于说明本专利技术而不用于限制本专利技术的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照本领域的常规条件。除非另外说明，否则所有百分比和分数按重量计。附图说明图I显示了由甘精胰岛素前体获得成熟的甘精胰岛素的转肽过程；图2为发酵后全菌蛋白SDS-PAGE图，图中泳道I为重组大肠杆菌全菌蛋白，图中箭头所示的目标蛋白条带为所表达的甘精胰岛素前体的融合蛋白，其分子量约17. 8KD ；图3为发酵后取发酵液进行Tricine SDS-PAGE分析的结果，图中泳道1、2、3为不同时间发酵时间的重组酵母上清，依次为诱导72h、60h和48h的结果，图中箭头所示为分泌 表达的甘精胰岛素前体；图4为大肠杆菌表达前体蛋白粗纯品的SDS-PAGE图，图中泳道1、2为大肠杆菌表达前体蛋白粗纯品；图5为酵母表达前体蛋白粗纯品的SDS-PAGE图，图中泳道I为酵母表达的前体蛋白的粗纯品；图6为酵母表达前体粗纯后的HPLC分析图，其分析条件为A 0. 1% TFA B 0. 1% TFA 80% 乙腈C 8 柱 15cm I. Oml/min 30% 45% B 梯度洗脱；图7为纯化后的甘精本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种制备甘精胰岛素及其类似物的方法，该方法包括如下步骤：(1)利用基因工程方法制备B链C端含多个碱性氨基酸的甘精胰岛素及其类似物的前体；(2)利用氨基酸侧链保护剂使胰酶特异性识别精氨酸或赖氨酸，在保护剂、胰酶的作用下获得带保护基团的甘精胰岛素及其类似物；或者不保护直接使用特异作用于Arg的梭菌蛋白酶或特异作用于Lys的胞内蛋白酶Lys？C；(3)任选地通过加入羧肽酶而脱除C末端未保护的碱性氨基酸；(4)脱保护得到甘精胰岛素及其类似物。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：夏晶，
申请(专利权)人：上海华谊生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：
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