本发明专利技术公开了一种烟草基因组分子标记探针与序列集合群及获得方法与应用，该探针和引物集合具有全部或者部分№9~25所示的任何一种核苷酸序列。本发明专利技术所提供的这些新的探针和引物序列集合，是来源于本专利发明专利技术人所分离鉴定的一系列新的微型反向重复转座元件。所述的探针与引物依次通过序列群、独立序列获得，新序列筛选与鉴别获得，并可应用于下列领域：1、烟草分子标记辅助育种，应用于传统烟草新品种的选择和培育，加快其进程；2、烟草遗传图谱的构建和烟草DNA指纹的鉴别；3、在烟草基因组中重要的功能基因定位和克隆；4、烟草重要农艺性状的早期鉴别和筛选；5、不同烟草品种或品系材料的亲缘关系鉴别；6、烟草产品（包括卷烟）的真伪鉴定。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物技术和基因工程
，进一步属于烟草基因研究与应用
，具体涉及一种烟草基因组分子探针与序列集合群及获得方法与应用。
技术介绍
烟草(Nicotianatabacum)属于爺科(Solanaceae)烟草属(Nicotiana),是一年生草本植物。对于植物学科的发展来说，无论是基础研究还是应用研究，烟草作为模式植物都起了很大的作用，如烟草的转基因研究、烟草有益基因分子标记等。尽管我国在烟草种质资源研究方面已做了大量研究工作，但由于受技术手段的限制及烟草各品种间遗传多样性低等原因，至今还未建成一张高密度、覆盖整个基因组的遗传图谱，严重影响了烟草重要农艺性状的遗传基础和遗传规律的研究。目前，在烟草中所应用的分子标记大部分为RAPD标记，尽管该检测技术简便，但重复性较差、可靠性较低且不能鉴别杂合子和纯合子。因此，迫切要求科研人员开发共显性、多态性高、重复稳定性好、简单易用、自动化程度高的新型分子标记技术，对于烟草品种的鉴别有重要意义。
技术实现思路
本专利技术的第一目的在于提供一种烟草基因组分子标记探针与序列集合群 ’另一目的在于提供一种获得烟草基因组分子标记探针与序列集合群的方法；第三目的在于烟草基因组分子标记的探针与序列集合群用于高分辨地鉴别烟草品种。本专利技术的第一目的是这样实现的，包括序列表中所列出的Ns 9" Na 25任一序列的全部或者部分序列。本专利技术的另一目的是这样实现的，包括序列群获得、独立序列获得、未知序列筛选、新序列筛选、新序列鉴别，具体包括 A、序列群获得搜索和聚集目前公开的烟草基因组原始序列，建立一个烟草基因组序列数据库，以MITE-Hunter软件扫描该数据库，挖掘出； B、独立序列获得侯选系列利用MITE二级结构的预测技术，归类MITE候选序列，并去除冗余序列，获得独立的MITE候选序列集合； C、未知序列筛选；以这些候选MITE序列为模板，同源搜索目前所有的MITE序列数据库，去除已知获已报道的MITE序列，并筛选出未知类型的MITE候选序列； D、新序列筛选以TD技术鉴定和分析每一类候选MITE序列在不同烟草品系的拷贝数和多态性，筛选出明确的MITE新序列集合； E、新序列鉴别利用筛选完成的MITE新序列集合，分别设计Southern杂交探针、MP引物和TD引物，以Southern杂交、IMP和TD方法逐一评价以上这些MITE新序列的应用价值，并最终确认一种高分辨各类烟草品种方法的烟草基因组分子标记的探针与序列集合群。本专利技术的第三目在于烟草基因组分子标记的探针与序列集合群应用于下列领域(I)烟草分子标记辅助育种，也就是烟草新品种的选择和培育；(2)烟草遗传图谱的构建和烟草DNA指纹的鉴别；(3)在烟草基因组中定位重要的功能基因并克隆；(4)烟草重要农艺性状的早期鉴别和筛选；(5)不同烟草品系的亲缘关系鉴别(如在混杂的烟草样品中鉴别其品系构成、烟草栽培品系与其野生种的区分等)；(6)烟草产品的真伪鉴定(如特定品牌的烟草制品其原料构成等)。MITE是一类广泛分布于动植物基因组中的DNA转座元件，具有以下特征 (1)其序列长度一般不超过500个核苷酸碱基； (2)其序列的5’和3’端分别具有末端反向重复(TerminalInverted Repeat, TIR),并可形成典型的发夹式二级结构，且同一家族成员的TIR序列高度保守； (3)在其转座到基因组的其他位置时，一般在插入点处产生靶标位点重复(TargetSite Duplication , TSD)的序列结构； (4)拷贝数较高，并偏好插入到基因组编码区。Southern杂交是一种进行基因组DNA特定序列定位的重要技术。其原理是利用琼脂糖凝胶电泳分离经限制性酶消化的DNA片段，将胶上的DNA变性并在原位转移至尼龙膜等固相支持物上，再与相对应标记探针进行杂交，通过用放射自显影或酶反应显色，检测特定DNA分子的含量及其位置。IMP是一种利用聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction, PCR)来扩增相邻两个MITEs间的序列所具有的长度多态性的分子标记技术。根据MITE的保守TIR区设计引物，利用MITE自身拷贝数高，在基因组中分布均匀的特点，通过特异的几对MP弓I物组合即可达到覆盖整个基因组的目的。在水稻、玉米等作物的遗传标记开发中作为一种理想分子标记手段，已用于遗传图谱的构建和标记的辅助育种等研究。TD是一种在扩增片段长度多态性基础上改进的分子标记技术。它可以利用高拷贝保守的转座子在基因组中散布分布的特点发展新的分子标记，用于遗传连锁分析。TD技术具有操作简单、准确性高等特点，在水稻、玉米和拟南芥遗传进化研究中已经得到广泛应用。本专利技术自主鉴定和分离的新MITE转座元件，烟草分子标记探针和引物序列集合，来源于一系列新的微型反向重复转座元件，这些MITE引物序列可应用于烟草分子标记技术的建立和开发，具体包括Southern杂交探针、MP引物和TD引物的设计和制备。这些MITE引物序列，在烟草分子标记辅助育种、烟草遗传图谱的构建、烟草DNA指纹的鉴别、烟草重要的功能基因基因定位并克隆、烟草重要农艺性状的早期鉴别和筛选、不同烟草品系的亲缘关系鉴别以及烟草产品的真伪鉴定等方面具有广泛的应用前景。附图说明图I为收集的24个烟草栽培样品的DNA多态性指纹图。烟草MITE元件的编号为Na :9。图中24个样品按I 24号的次序分别为MSK326、MS云烟85、MS云烟87、红大、K346、V2、z 烟 201、z 烟 202、z 烟 203、z 烟 97、z 烟 98、中烟 100、PVH19、z 烟 96、z 烟 99、z 烟100、云烟 108、云烟 105、KRK26、YH05、NC102、NC97、XYN87 和 KRK28。图2为烟草基因组中Ns :13序列的转座事件鉴定。C为对照gDNA样品，其来源为组织培养前取样的烟草品种K326的母体植株。I、号样品为来源于K326母体植株的一个幼嫩的叶片进行组织培养后的八个组培苗gDNA样品。核苷酸和氨基酸序列表中包括Pst I接头序列(Ns UNo :2)、T1P1A引物(Ns :3)、T1P2B引物(Ns :4)、接头特定引物Cl (Na :5)、接头特定引物C2 (Na :6)、T9P1A引物(Ns :7)、T9P2A引物(Ns 8)和编号为Ns :9 25的人工序列。具体实施例方式下面结合附图和实施例对本专利技术作进一步的说明，但不以任何方式对本专利技术加以限制，基于本专利技术教导所作的任何变换或改进，均落入本专利技术的保护范围。本专利技术确定和设计的高分辨各类烟草品种方法的烟草基因组分子标记的探针与序列集合群，其核苷酸组成分别对应于本专利技术序列表中所列出的Ns 9"25所示序列的全部或者部分序列。本专利技术所述的烟草基因组分子标记的探针与序列集合群获得方法，包括序列群获得、独立序列获得、未知序列筛选、新序列筛选、新序列鉴别，具体包括 所述的烟草MITE候选序列群的获得，是搜索和聚集目前公开的烟草基因组原始序列，建立一个烟草基因组序列数据库，以MITE-Hunter软件扫描该数据库，挖掘出； 所述的独立的烟草MITE候选序列的获得，是利本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种烟草基因组分子标记探针与序列集合群，其特征在于：包括序列表中所列出的№9~№25任一序列的全部或者部分序列。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：李文正，刘勇，王丙武，张家瑞，顾华国，邵岩，
申请(专利权)人：云南省烟草农业科学研究院，
类型：发明
国别省市：
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