本发明专利技术涉及获自修饰的泛素的新的异源多聚体蛋白，其能够以高亲和力结合纤维连接蛋白的额外结构域B（ED-B）。此外，本发明专利技术涉及包括融合到药学和/或诊断活性成分上的所述重组蛋白的融合蛋白。本发明专利技术进一步涉及所述蛋白在医学治疗方法中的应用。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及能够结合纤维连接蛋白额外结构域B (ED-B)的新的异源多聚体蛋白。此外，本专利技术涉及包括融合到药学和/或诊断活性成分上的所述异源多聚体结合蛋白的融合蛋白。本专利技术进一步涉及产生这种异源多聚体结合蛋白或融合蛋白的方法和包含所述异源多聚体结合蛋白的药学的和/或诊断的组合物。另外，本专利技术涉及包括编码所述蛋白的DNA的文库。进一步的实施例中，本专利技术涉及编码所述异源多聚体结合蛋白或融合蛋白的多核苷酸、包括所述多核苷酸的载体和包括所述蛋白的宿主细胞、融合蛋白、载体和/或多核苷酸。优选的实施方式中，所述异源多聚体结合蛋白或融合蛋白包括在药物或诊断剂中。另夕卜，描述了制造所述重组蛋白或融合蛋白的方法以及所述蛋白在医学治疗方法中的应用。
技术介绍
对于由氨基酸组成的，但不是免疫球蛋白的结合分子的需求日益增加。迄今为止，虽然抗体代表确定的最好的结合分子，但是因为免疫球蛋白分子具有较大的缺陷，为了以高亲和力和高特异性靶向配体，仍然需要新的结合分子。尽管它们能很容易地制造且它们可指向几乎任何一个靶，它们仍然具有相当复杂的分子结构。仍然需要能够易于操作的更小的分子取代抗体。这些可替换的结合剂能有利地用于，例如诊断、预防和疾病的治疗的医疗领域。蛋白具有相对确定的通常被称为蛋白质骨架的三维结构，且可作为用于设计所述可替换的结合剂的起始材料。这些骨架通常包含一个或多个区域，这些区域受特异的或随机的序列变化作用，且经常发生这种序列随机化，以制造蛋白质文库，从蛋白质文库中可选出特异的结合分子。预期具有比抗体更小的尺寸，且对靶抗原具有相当、甚者更好的亲和力的分子在药物动力学性能和免疫原性方面超过抗体。先前的许多方法确实使用蛋白质骨架作为结合蛋白的起始材料。例如，在WO99/16873中，开发对某种配体表现出结合活性的脂质运载蛋白(Iipocalin)家族(所谓的Anticalin (一种抗体类似物))的修饰蛋白。利用遗传工程的方法，通过在其天然配体结合口袋(pocket)进行氨基酸置换，对脂质运载蛋白家族肽的结构进行修饰。类似免疫球蛋白，Anticalin可用于确定或结合分子结构。在某种意义上类似于抗体，柔性环形结构被修饰；这些修饰能够确定与天然配体不同的配体。WO 01/04144描述在蛋白本身缺少结合位置P片结构中的蛋白表面上人工产生的结合域。通过这种方法重新产生人工的结合域，例如能够获得Y-晶状体球蛋白-一种眼睛晶体结构蛋白-的变体，其对配体具有高亲和力和特异性。和已经出现且由上述提及的拟抗体的柔性环形结构形成的结合位置的修饰相比，这些结合域重新在P片的表面上产生。然而，WO 01/04144只描述用于产生新的结合性能的相对大的蛋白的变化。由于它们的尺寸，根据WO 01/04144蛋白仅能在遗传工程水平上通过需要某些努力的方法来修饰。此外，为了维持蛋白的整体结构，迄今为止公开的蛋白中只有总基酸相对小的百分数部分被修饰。因此，只有相对小的蛋白表面的区域是可用的，其能用于产生以前不存在的结合性能。而且，WO 01/04144只公开对Y-晶状体球蛋白产生的结合性能。WO 04/106368描述以泛素蛋白为基础的人工结合蛋白的产生。泛素是小的、单体的、和细胞溶质的蛋白，其序列高度保守且出现在所有已知的从原生动物到脊椎动物的真核细胞中。其在生物体的细胞蛋白的可控降解的调节中充当至关紧要的角色。为了这种目的，用于降解的蛋白在它们通往酶的级联反应期间共价地连接到泛素或多聚泛素链上，且由于这种标签选择性地降解蛋白。根据最近的结果，泛素或泛素的蛋白标签，也分别在其他细胞程序中充当重要的角色，例如几种蛋白的输入或其基因调节。除了它的生理机能的阐明之外，由于它的结构和蛋白化学性质，泛素是主要地研究目标。泛素的多肽链由76个在非常紧密的a/0结构(Vijay-Kumar，1987)中折叠的氨基酸组成几乎87%的多肽链涉及通过氢键的二级结构元件的形成。主要的二级结构是三个和半个a螺旋转角和由四股组成的反平行P片。这些元件的特征排列通常被认为是所 谓的类泛素折叠基序(ubiquitin-like folding motif)-反平行0片暴露在后侧上的蛋白表面，其中a螺旋垂直地堆积在顶上。进一步的结构特征是蛋白内部a螺旋和P片之间标记的疏水区域。因为它的小的尺寸，能通过化学合成和依靠生物科技的方法两种途径进行泛素的人工制备。由于有利的折叠性能，能通过遗传工程利用微生物例如Escherichia coli以相对大的数量在细胞溶质或在外周胞质空间制造泛素。因为外周胞质中占优势的氧化条件，后面的方法通常专供分泌蛋白的制造之用。由于简易和有效的细菌制备，泛素能用作其他外源蛋白的融合伴侣，以制备难于生产的产品。依靠融合，能获得良溶解性改的泛素和因此获得提高的产量。与抗体或其他可替换的骨架相比，以泛素蛋白(也称作载脂蛋白拟抗tt )为基础的人工的结合蛋白具有的优势是小尺寸和高稳定性、高亲和力、高特异性、有效地微生物制造成本、和血清半衰期的调整。然而，在新的治疗方法方面，仍然需要进一步开发对于特异的靶具有高亲和力的那些蛋白。为了获得人工的结合蛋白，WO 05/05730大体描述了泛素骨架的应用，没有提供如何修饰泛素蛋白才能获得对纤维连接蛋白的ED-B特异的和高亲和力的结合的解决方法。WO 2008/022759描述重组结合蛋白，其中FYN激酶的Src保守3结构域(SH3)用于获得新的结合蛋白。发现为了开发蛋白治疗和/或诊断，能通过突变RT环和/或Src环设计特异性的靶。像脂质运载蛋白(Iipocalins)中被用作骨架一样，要诱变的氨基酸残基位于可变的柔性环区域内，模仿基础的抗体/抗原结合功能的原理。这种相互作用位置的整体的适应性是主要的焓驱动过程，其中通过相互作用位置，抗体结合到抗原决定基上；然而，通过结合柔性的互补决定区之后的灵活性的损失，这种过程导致不利的熵贡献。此外相反地，利用作为骨架的泛素，首先专利技术人在柔性环区之内不改变氨基酸残基，但是在@片区域的固定的和不可改变的3链之内或接近邻近的3链改变氨基酸残基改变。在不可改变的和固定的P链之内或接近邻近的作为ED-B结合区的泛素的P链上选择氨基酸残基的优势具体如下认为结合伴侣已经出现适于紧密结合的补充几何体。因此，这些相互作用涉及结合伴侣的更加严格的结构在形状、电荷和亲水的/疏水的元件中的互补。这些严格的部分相互作用，以最优化界面且调节生物学的功能。纤维连接蛋白(FN)是健康的组织和体液中丰富地表达的高分子量的细胞外的基质糖蛋白类(matrix glycoproteins)中重要的一类。它们主要的任务在于促进细胞与许多不同的细胞外基质(extracellular matrices)的粘附。培养基中非转型细胞表面上纤维连接蛋白的存在和在转型细胞上的不存在，形成了作为重要的粘附蛋白的纤维连接蛋白的确定。它们对许多不同的其他分子有影响，例如，胶原、硫酸乙酰肝素蛋白多糖(heparansulphate-proteoglycans)和纤维蛋白，因此,调节细胞的形状和细胞骨架的形成。另外，它们是胚胎发生期间使细胞迁移和细胞分化的原因。它们也在伤口愈合中扮演重要的角色，在伤口愈合中它们促进巨噬细胞和其他免疫本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...
【专利技术属性】
技术研发人员：阿诺德·施托伊尔纳格尔，埃里克·菲德莱尔，马库斯·菲德莱尔，安雅·库纳特，约尔格·纳坎普，托马斯·戈特勒，曼亚·格洛塞尔，伊尔卡·亨泽根，
申请(专利权)人：塞尔蛋白质股份有限公司，
类型：发明
国别省市：
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