本发明专利技术公开了一种油菜抗裂角性状主效基因位点分子标记及应用，步骤包括：1）利用在抗裂角性状上有显著差异的甘蓝型油菜品种中双11和73290杂交，后代自交获得抗裂角性状分离的F2和F2:3分离群体；2）利用SSR引物对亲本DNA进行多态性的筛选，通过对F2代分离群体进行SSR分子标记基因型分析构建遗传连锁图谱；3）通过对F2和F2:3分离群体进行田间实验和考种获得抗裂角性状的表型数据；4）结合开发的高密度分子标记遗传连锁图谱，以及分离群体的基因型和表型数据，利用QTLCart2.5软件进行QTL检测，检测到甘蓝型有爱A9连锁群上控制油菜抗裂角的主效基因位点Psr.A9，与该主效基因位点紧密连锁的分子标记BrSF0007-39，利用该标记进行辅助选择可大大提高抗裂角育种的选择效率。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于分子生物学及遗传育种
，具体涉及甘蓝型油菜抗裂角性状主效基因位点及其紧密连锁的分子标记，同时还涉及该分子标记在油菜高抗裂角育种中的应用。
技术介绍
油菜是世界第三大油料作物，也是我国继水稻、小麦、玉米和大豆之后的第五大农作物，全世界大约13%的植物油来自于油菜。除了作为食用油的主要原料之外，油菜也是重 要的工业原料和欧盟主要成员国可再生能源的主要生物资源。我国油菜的种植面积和总产量均占世界的30%左右，它不仅关系到我国种植业结构的调整、优化和近亿农民的增收，也关系到满足人民生活水平提高、膳食结构改善及保障国家食物安全的需要，因此，加强油菜生产意义重大。机械化是现代农业发展的方向，而油菜角果易开裂正是目前制约油菜产业机械化收获的瓶颈，严重地影响着油菜产业生产效率的提高。由于目前生产上利用的甘蓝型油菜在成熟时特别容易裂角，一般都会造成产量损失10%左右，机械化收割损失将更加严重。如果遇到成熟期气候比较恶劣，产量损失可高达50%以上，造成丰产不丰收。而且，易裂角除了带来产量损失外还会造成一系列其他的不良影响，如落地籽粒在条件适宜时会萌发形成自生苗，影响下茬作物生长，同时也增加了使用除草剂去除再生苗的成本。未来随着转基因油菜的推广应用，角果开裂种子散落还会带来生态风险。目前生产上为了避免裂角造成的产量损失和对下茬作物的不良影响，通常是提前收获，但这样做会造成油菜籽含油量下降，种子中叶绿素含量过高，影响食用油的品质。因此，选育抗裂角的油菜品种对油菜生产显得极为重要。但一般甘蓝型油菜品种间抗裂角特性变异不大，在其他的近缘种中虽然存在抗裂角特性，但通过远缘杂交很难除去不良农艺性状的影响。虽然目前在拟南芥中已有许多与角果发育和开裂有关的基因被克隆，利用这些基因来抑制油菜角果开裂和防止种子损失已经成为可能，但有关基因转化的结果是导致角果成筒状结构，致使角果完全不能开裂，造成脱粒十分困难。因此，对甘蓝型油菜抗裂角资源的发掘以及对抗裂角性状主效基因位点的开发，有助于我们未来培育适用的抗裂角优异甘蓝型油菜品种。大多数重要的农艺性状均表现数量性状的遗传特点，如产量性状、含油量、成熟期、品质、抗旱性等。数量性状易受环境条件的影响，因此选择效果不好。传统育种方法周期长，主要是由数量性状造成的。由于分子标记技术的发展，人们已可将复杂的数量性状进行分解，像研究质量性状基因一样对控制数量性状的多个基因进行研究。数量性状基因座(quantitat ive trait locus,简称QTL)是在高密度的遗传图谱基础上,通过一定实验设计，获得分子标记，借助Mapmaker软件分析确定控制某一性状的基因在染色体上的位置。当目标性状由少数几个基因控制时用标记选择，对发掘遗传潜力非常有效。本研究通过遗传分析及QTL定位，旨在筛选出对油菜抗裂角具有正向效应的QTL，用于油菜抗裂角的分子标记辅助选择、分子育种及抗裂角基因的克隆。
技术实现思路
本专利技术目的是在于提供了一个油菜抗裂角性状的主效基因位点的分子标记BrSF0007-39，该分子标记不仅有助于辅助筛选抗裂角材料，同时也有助于深入了解中双11号高抗裂角性状构成的分子机理，为今后主效QTL的精细定位及克隆奠定基础。本专利技术的另一个目的在于一个油菜抗裂角性状的主效基因位点的分子标记的弓I物，对今后中双11号及其及其衍生品系的抗裂角性状育种提供了极大的便利。本专利技术还有一个目的是提供了一个油菜抗裂角性状的主效基因位点的分子标记在油菜产量育种中的应用。分子标记筛选主要优点就是可以在苗期筛选，大大节约成本和筛选工作量。常规筛选方法需要等到油菜完全成熟以后才能选择，不能在苗期淘汰掉绝大部分不抗裂角的材料，进而可以快速筛选出高抗裂角株系用于油菜抗裂角育种。 为了实现上述的目的，本专利技术采用以下技术措施一种油菜抗裂角性状主效基因位点的分子标记，其筛选步骤是a)利用在抗裂角指数上有极显著差异的油菜品种中双11(抗裂角指数为0. 83)和73290 (抗裂角指数为0. 48)杂交，杂种Fl代自交产生F2和F2:3代分离群体；b)采用CTAB法提取亲本中双11和73290及F2分离群体的叶片总DNA，过程中所用到的试剂包括提取液(I. 4M NaCiaOOmM Tris, pH8. 0,20mM EDTA, pH8. 0，2%CTAB)、氯仿、异戊醇、无水乙醇；c)合成油菜SSR引物，并对亲本DNA进行PCR扩增，产物在变性聚丙烯酰胺凝胶中电泳，染色和显影后对条带的大小进行判别，筛选多态性引物；d)利用多态性引物对F2代分离群体进行基因型分析和遗传图谱的构建，结合其抗裂角指数的性状数据进行QTL定位，检测到油菜第9染色体具有一个QTL位点Psr. A9 (见表2)，与其性状紧密连锁的SSR标记为BrSF0007_39，该标记位于QTL位点Psr. A9的置信区间内，在中双11号中可扩增出大小为204bp和228bp的两条带，在73290中只能扩出大小为228bp和260bp的两条带(图4)，引物序列为BrSF0007_39_F 5’ -ACCAAACCAAACCAAACCAA-3’，BrSF0007_39-R : 5’ -CGATCTTTTGGTGGAAGGAA-3’ ；Joinmap3. 0作图软件用于对所获得的多态性标记位点进行连锁分析，WinQTL cart2. 5软件用于QTL分析。本研究用到的两个亲本材料抗裂角指数相差接近一倍，均由中国农业科学院油料作物研究所油菜生物技术育种课题组科技人员在王汉中研究员带领下育成。中双11号及73290来源详见遗传资源来源披露登记表。油菜两亲本、后代分离群体单株抗裂角指数的测定参照文献(文雁成，甘蓝型油菜抗裂角品种的筛选与分析，作物学报，2008，I)中的随机碰撞法完成，植物叶片总DNA的提取、PCR及聚丙烯酰胺凝胶电泳均为常用的分子生物学技术，通常按照常规条件如Sambrook等人,分子克隆实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989),和 Draper 等人,Blackwell,科学出版社，1988 中的条件进行。实验过程中涉及的所有试剂均可从商业途径获得，并按照实验手册中的条件或所用试剂制造厂商所建议的条件使用。利用上述技术措施，申请人最终获得了一种油菜抗裂角性状主效基因位点的分子标记，具体如下该标记位于QTL位点Psr. A9的置信区间内，其引物序列为BrSF0007_39_F 5’ -ACCAAACCAAACCAAACCAA-3’，BrSF0007-39-R :5’ -CGATCTTTTGGTGGAAGGAA-3 。Psr. A9,该主效基因位点位于油菜第9染色体，和分子标记BrSF0007-39紧密连锁，利用QTLCart2. 5软件分析测得其对油菜抗裂角性状的贡献率为32. 7%,加性效应为0. 87，显性效应为0. 97，属于完全显性遗传。一种抗裂角主效基因位点Psr. A9的分子标记BrSF0007_39在油菜产量育种中的应用利用Psr. A9位点的分子标记BrSF0007_39对两亲本的F3代进行基因型鉴定，并在收获后进行抗裂角性状的考种。结果表明，通过分子标记辅助本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种油菜抗裂角性状主效基因位点的分子标记，其筛选步骤是：a)利用在抗裂角指数上有极显著差异的油菜品种中双11和73290杂交，杂种F1代自交产生F2和F2:3代分离群体；？b)采用CTAB法提取亲本中双11和73290及F2分离群体的叶片总DNA；c)合成油菜SSR引物，并对亲本DNA进行PCR扩增，产物在变性聚丙烯酰胺凝胶中电泳，染色和显影后对条带的大小进行判别，筛选多态性引物；d)利用多态性引物对F2代分离群体进行基因型分析和遗传图谱的构建，结合其抗裂角指数的性状数据进行QTL定位，检测到油菜第9染色体具有一个QTL位点Psr.A9，与其性状紧密连锁的SSR标记为BrSF0007？39，该标记位于QTL位点Psr.A9的置信区间内，在中双11号中扩增出大小为204？bp？和228？bp的两条带，引物序列为BrSF0007？39？F：5’？ACCAAACCAAACCAAACCAA？3’，即SEQ？ID？NO:1，BrSF0007？39？R：5’？CGATCTTTTGGTGGAAGGAA？3’，即SEQ？ID？NO:2。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：王汉中，华玮，胡志勇，刘贵华，王新发，师家勤，黄顺谋，杨庆，
申请(专利权)人：中国农业科学院油料作物研究所，
类型：发明
国别省市：
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