本发明专利技术涉及一种酵母细胞，尤其涉及一种重组酵母细胞，所述细胞缺乏NADH依赖的甘油合成所需的酶活性，或者与所述细胞相应的野生型酵母细胞相比，所述细胞具有降低的与NADH依赖的甘油合成有关的酶活性；所述细胞包括一个或多个编码NAD+依赖的乙酰化乙醛脱氢酶(EC?1.2.1.10)活性的异源核酸序列。本发明专利技术进一步涉及根据本发明专利技术的细胞在乙醇制造中的用途。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及一种具有生产理想发酵产品能力的重组酵母细胞、通过基因改造构建所述酵母细胞、以及一种使用所述酵母细胞生产发酵产品的工艺。
技术介绍
按体积计，目前利用酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)生产乙醇是工业生物技术中一种最大规模的发酵工艺。正在进行的一项全球性研究工作的目的是扩大酿酒酵母的底物范围，以使该底物能够包括木质纤维素水解产物，尤其是能够包括来自非食品原料(如富含纤维素、半纤维素和/或果胶的能源作物、农业残留物、林业残留物或工业/消费者废物)的木质纤维素生物质的水解产物，从而提高生产能力、稳健性和产品产量。 木质纤维素生物质是丰富的，然而通常情况下，野生型生产乙醇的微生物比如酿酒酵母并不易于对该木质纤维素生物质进行发酵。该生物质必须先进行水解，水解产物常常是各种单糖和寡糖的混合物，且并非所有这些产物都是野生型微生物的适宜底物。进一步地，该水解产物通常包含乙酸，尤其在水解果胶或半纤维素时会形成作为副产物的乙酸；依赖于水解类型，该水解产物还包含一种或多种其他副产物、或对发酵可能有不利影响的残留试剂。尤其是，据报道，乙酸对野生型和基因改造型酿酒酵母菌株进行糖发酵的动力学和/或化学计量学有不利影响，并且在培养基PH值较低时会大大增强乙酸的毒性(Helle 等 Enzyme Microb Technol 33 (2003)786-792 ;Bellissimi 等 FEMS Yeast Res9(2009)358-364)。现已提出了各种方法，以通过基因改造来改善生产乙醇生物体的发酵性能、以及改善生物质水解工艺。例如，A. van Maris等以综述形式给出了由生物质水解产物进行乙醇发酵生产的进展概述(Antonie van Leeuwenhoek(2006)90 :391-418)。其中，引用了酿酒酵母各种可能的改造方式和各种水解木质纤维素生物质的方法。与基于酵母进行乙醇生产的化学计量学相关的主要挑战是总会以副产物的形式形成大量甘油。据估计，在典型的工业乙醇生产工艺中，会有高达约4% (重量)的糖原料转化成甘油(Nissen等Yeast 16(2000)463-474)。在厌氧生长的理想条件下,转化为甘油的糖原料甚至会更高，如高达约10%。厌氧条件下的甘油生成，主要与氧化还原代谢相关。在酿酒酵母的厌氧生长过程中，通过乙醇发酵发生糖异化作用。该过程中，在糖酵解的甘油醛-3-磷酸脱氢酶反应中形成烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH);通过丙酮酸的脱羧作用形成的乙醛经由NAD+依赖的乙醇脱氢酶转化成乙醇，同时NADH通过该过程被再氧化。当NAD+至NADH的纯还原反应发生在代谢的其他地方时，氧化还原中性异化途径的固定化学计量学会出现问题。厌氧条件下，酿酒酵母中NADH的再氧化严格依赖于糖至甘油的还原反应。由糖酵解中间产物二羟丙酮磷酸至3-磷酸甘油的还原起始甘油的形成；其中，由NAD+依赖的甘油3-磷酸脱氢酶催化二羟丙酮磷酸至3-磷酸甘油的还原反应。随后，该反应中形成的3-磷酸甘油被甘油3-磷酸酶水解，产生甘油和无机磷酸。因此，甘油是利用酿酒酵母进行乙醇厌氧生产过程中的主要副产物，而这是不期望的，因为甘油的生成降低了糖至乙醇的整体转化。进一步地，乙醇生产厂废水中存在的甘油，可能会带来废水处理的成本。
技术实现思路
本专利技术的一个目的在于提供一种新的重组细胞，所述重组细胞适合由碳水化合物、尤其是从木质纤维素生物质获得的碳水化合物进行乙醇的厌氧发酵生产；当所述重组细胞用于乙醇的发酵生产时，与所述重组细胞相应的野生型生物体相比，所述重组细胞生成的甘油降低，或者缺乏甘油的生成。本专利技术进一步的目的是提供一种在厌氧酵母培养物中发酵制造乙醇的新方法；在所述方法中，不形成甘油，或者形成的甘油至少低于使用已知酿酒酵母菌株的方法。本专利技术可以满足的一个或更多进一步目的在说明书和权利要求书中是显而易见的。本专利技术人已经意识到，能够通过提供特定的重组细胞来满足这些目的中的一个或 多个；其中，所述特定的重组细胞中已并入其他特定的酶活性，从而能够使碳水化合物发酵过程形成的NADH再氧化；另外，所述特定的重组细胞缺少NADH依赖的甘油合成所需的酶活性时,也能够使碳水化合物发酵过程形成的NADH再氧化。因此，本专利技术涉及一种重组酵母细胞，所述细胞包含一个或多个编码NAD+依赖的乙酰化乙醛脱氢酶(EC I. 2. I. 10)活性的重组的、尤其是异源的核酸序列。本专利技术人尤其意识到有利地是提供一种细胞，所述细胞无NADH依赖的甘油合成所需的酶活性，或者所述细胞具有降低的NADH依赖的甘油合成所需的酶活性。因此，本专利技术尤其涉及一种重组酵母细胞，所述重组酵母细胞包含一个或多个编码NAD+依赖的乙酰化乙醛脱氢酶活性编码的异源核酸序列，其中，所述细胞缺乏NADH依赖的甘油合成所需的酶活性(即没有所述活性)，或者其中与所述细胞相应的野生型酵母细胞相比，所述细胞具有降低的与NADH依赖的甘油合成相关的酶活性。本专利技术进一步意在一种根据本专利技术所述的细胞在乙醇制造中的用途。尤其是，本专利技术进一步意在一种制造乙醇的方法，所述方法包括由可发酵碳水化合物和由乙酸制造乙醇，所述制造过程使用酵母细胞在厌氧发酵条件下进行，所述细胞表达乙酰-辅酶A合成酶活性和NAD+依赖的乙酰化乙醛脱氢酶活性；优选地，所述细胞缺乏由碳水化合物合成甘油的生化途径所需的酶活性，或与野生型酿酒酵母细胞相比，所述细胞具有降低的与由碳水化合物合成甘油的生化途径相关的酶活性。有利地是，根据本专利技术所述，在甘油乙醇的摩尔比小于0.04 I、尤其小于0. 02 I、优选小于0.01 I的情况下，生产乙醇。根据本专利技术的方法，可能不存在(未检测到)甘油生成，但至少在一些实施例(其中，NADH依赖的甘油合成降低，但不能完全禁止)中，可能作为副产物生成一些甘油，如甘油乙醇的比例为0.001 I或更高。附图说明图I示意性示出了基因改造过程，该过程可作为制造根据本专利技术细胞的一部分而进行；图2示出了生长在葡萄糖(20g/l)上的不同酿酒酵母菌株的厌氧分批培养物中的生物质和产物浓度；乙酸(2.0g/l)自发酵开始便存在(图A和B)、或者在箭头指示的时间点进行添加(图C和D);生长条件了 = 301，？册.0;符号U60nm处的光密度; ，葡萄糖；〇，乙醇；■，乙酸；口，甘油；每个曲线图代表两个独立重复试验中一个的值，得到的数据差异小于5%;图A :酿酒酵母ME076(GPD1 GPD2);图B :酿酒酵母MZ132 (gpdl Λ gpd2 Λ过表达大肠杆菌(Ε. coli)mhpF基因)；图(酿酒酵母頂Z132(gpdlAgpd2A过表达E. colimhpF基因);图D :生长在葡萄糖(20g/l)上的酿酒酵母IMZ127 (gpdl Δ gpd2 Δ )。具体实施例方式本专利技术通过提供一种重组酵母细胞、尤其是酿酒酵母，能够完全消除甘油的产生、或者至少显著降低甘油的产生，这样可以通过NADH依赖的乙酸至乙醇的还原反应使NADH再氧化这不仅有利于避免甘油的产生或至少降低甘油的产生，而且由于NADH再氧化过程中形成的产物也是期望产物，即乙醇，所以本专利技术的方法也提供了增加的产物产量；其 由于一般可在本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2009.07.24 EP 09166360.91.一种重组的酵母细胞，尤其是一种转基因酵母细胞，所述细胞包含一个或多个编码NAD+依赖的乙酰化乙醛脱氢酶(EC I. 2. I. 10)活性的重组的、尤其是异源的核酸序列；所述细胞缺乏NADH依赖的甘油合成所需的酶活性，或者与所述细胞相应的野生型酵母细胞相比，所述细胞具有降低的与NADH依赖的甘油合成有关的酶活性。2.根据权利要求I所述的细胞，其中，所述细胞包含一个或多个编码NAD+依赖的乙酰化乙醛脱氢酶的异源核酸序列；所述NAD+依赖的乙酰化乙醛脱氢酶表示为SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:29、或SEQ ID NO :2或SEQ ID NO :29的功能同系物；优选地，所述同系物与SEQID NO :2或SEQ ID NO :29具有至少60%、尤其至少70%、更尤其至少80%、至少90%、至少95%、至少97%、至少98%、或至少99%的序列一致性。3.根据权利要求2所述的细胞，其中，所述细胞包含编码所述脱氢酶的核酸序列，所述核酸序列包括根据SEQ ID NO USEQ ID NO :28或SEQ ID NO :32的序列，或所述核酸序列包括SEQ ID NO :1、SEQ ID NO 28或SEQ ID NO 32的功能同系物；优选地，所述同系物与SEQ ID NO :I具有至少60%、尤其至少70%、更尤其至少80%、至少90%、至少95%、至少97%、至少98%、或至少99%的序列一致性。4.根据前述权利要求中任一项所述的细胞，其中，所述细胞无NAD依赖的甘油3-磷酸脱氢酶活性，或者与所述细胞相应的野生型细胞相比，所述细胞具有降低的NAD依赖的甘油3-磷酸脱氢酶活性；和/或，其中，所述细胞无磷酸甘油磷酸酶活性，或者与所述细胞相应的野生型细胞相比，所述细胞具有降低的磷酸甘油磷酸酶活性。5.根据权利要求4所述的细胞，其中，所述细胞的基因组在至少一个基因中包含突变，所述基因选自由GPD1、GPD2、GPPl和GPP2所组成的组；所述突变可以是敲除突变；与所述细胞相应的野生型酵母基因相比，所述敲除突变可以是所述至少一个基因的彻底缺失。6.根据权利要求4或5所述的细胞，其中，所述细胞无编码NAD+依赖的甘油3-磷酸脱氢酶(EC I. I. 1.8)的基因。7.根据前述权利要求中任一项所述的细胞，所述细胞包含一个或多个编码乙酰-辅酶A合成酶活性(EC 6. 2. I. I)的核酸序列和一个或多个编码NAD+依赖的乙醇脱氢酶活性(ECI.I. I. I)的核酸序列。8.根据前述权利要求中任一项所述的细胞，其中，所述细胞是...
【专利技术属性】
技术研发人员：雅各布斯·托马斯·普若克，安东尼斯·J·A·范马里斯，维克多·加布里埃尔·格达拉普梅迪纳，
申请(专利权)人：代尔夫特科技大学，
类型：发明
国别省市：
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