本发明专利技术涉及用于检测未知生物样品中的可溶性BAG3蛋白的存在和/或浓度的方法且测定优选地利用抗体通过ELISA测定来进行，所述抗体优选为单克隆抗体。呈可溶形式的所述蛋白的存在与心脏病相关或与胰腺肿瘤的存在相关。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术属于诊断血清标志物的
现有技术BAG3 (RefSeq NP_004272 ;基因ID 9531)是74kDa的胞浆蛋白，尤其集中于粗面内质网中。最近已描述了 40kD的胞衆形式与突触体相关(Brown等人.，2008)。并且,在大肠杆菌(E. coli)中表达了重组形式和一些缺失突变体(Rose等人2007 (a))。在人类中，bag3基因表达在肌细胞、少数其它正常细胞类型以及一些癌症(白血病和淋巴瘤、骨髓瘤、胰腺癌和甲状腺癌、黑素瘤、骨肉瘤等)中是组成型的(Romano等人，2003 ；Homma 等人.2006 ；Chiappetta 等人.，2007, Rosati 等人.，2007)，并在多种细胞类型中响应于不同的应激原被诱导暴露于高温的胰腺癌系(Liao等人.2001)，与重金属一起孵育或经受高温的HeLa细胞(Pagliuca等人.，2003)，用氧化应激诱导剂马来酸二乙酯处 理的白细胞(Bonelli等人.，2004)，被光损伤的鼠类视网膜细胞(Chen等人.，2004)，用低强度超声处理的Molt-4细胞(人类白血病T细胞)(Tabuchi等人.，2006)，暴露于HIV-I病毒的人类小胶质细胞(Rosati等人.，2007a)。这些发现表明BAG3表达的调控是针对应激的细胞应答中的重要组成部分，并且与bag3基因的启动子中对在多种形式的细胞应激中激活的转录因子HSF (热休克因子)I反应的元件的存在相一致。HSFl活性的调节导致BAG3蛋白的细胞水平的显著降低，表明该调控子在bag3的表达中起重要作用(Franceschelli等人·，2008)。EGRl是参与bag3表达的调控的另一转录因子(Gentilella等人·，2008)。BAG3影响原发癌细胞的存活的第一个证据来自对原发性白血病细胞的研究，所述原发性白血病细胞来自患有B细胞慢性淋巴样白血病(B-CLL)的24位患者和患有急性成淋巴细胞性白血病(ALL)的11位儿童通过使用特异性反义寡脱氧核苷酸来降低BAG3水平导致了凋亡小体的100%以上的增加(P < 0.001)，还描述于EP 1465927A1和U. S. 7，537，760B2中。因此与未处理的细胞和用相同的化疗药物处理的细胞相比较，这些细胞中的凋亡的百分比显著增高(Leone和Turco, 2001, Romano等人.，2003a, 2003b)。在正常白细胞中，证明该基因的过表达证明显著降低了凋亡应答(Bonelli等人.，2004)。随后，人类甲状腺组织的分析显示正常组织和甲状腺肿样品检验为BAG3表达阴性，而癌症样品明显地检验为阳性，且在间变性肿瘤中观察到较高的BAG3表达。在其他肿瘤中，诸如骨肉瘤和黑素瘤细胞，bag3特异性SiRNA导致基底细胞的降低的存活，显示了与化疗剂的显著协同作用；小鼠中移植的人类黑素瘤细胞中的BAG3敲低显著降低了肿瘤生长，且提高了动物的存活(Ammirante等人.，出版中)。另一方面，bag3过表达导致了用化疗药物处理的或暴露于其他促凋亡刺激物的癌细胞的降低的凋亡(Rose等人· ,2007(b)) ο虽然已在不同的细胞系统中检测了胞浆BAG-3的存在，且发现其与肿瘤(例如，白血病或甲状腺癌)相关，以及更通常与细胞存活相关，但目前为止BAG3的可溶形式从未被描述，且其在血清中的存在从未与心区不适的状况相关联。因此，本专利技术解决了鉴定BAG-3蛋白的新型分泌型可溶形式的问题，和其在人类和其他哺乳动物中产生的问题，其以令人惊奇的特异性和灵敏的方式与特定的疾病状况相关。专利技术概述本专利技术涉及用于检测未知生物样品中的可溶性BAG3蛋白的存在和/或浓度的方法，所述方法包括以下步骤a.获得生物样品，其由血清或血浆组成， b.确定所述生物样品中可溶性BAG3的存在或浓度，c.将获自样品的值与参考值或获自生物参考样品的值相比较，d.任选地，进一步确定相似值的组(和可能地其进一步分成具有统计学上差异的平均值的组)，e.将可溶性BAG3的存在和/或水平与病理状况相关联，其中所述病症是心脏病或胰腺癌。优选地，定量步骤(b)利用抗体通过ELISA来进行，所述抗体优选地是单克隆的。可选地，可溶性蛋白可分离自患者的血清。所提出的测定方法允许心脏病患者组与健康人组的统计学显著的分离，优选地在相当的年龄的组中。还可将所述患有心脏病的患者分层到处于增高的风险(心力衰竭，HF)的患者的亚组中。附图描述图I.显示大鼠中正常心脏组织中的和诱导梗死之后的BAG3蛋白的表达的免疫组织化学切片。图2.利用抗BAG3抗体对来自心肌细胞的裂解物和上清液进行的蛋白质印迹。图3.利用抗BAG3抗体对从患有慢性缺血性心脏病的患者的血清中纯化的可溶性蛋白的蛋白质印迹分析。图4.用于BAG3检测的ELISA的校准曲线。图5.根据年龄组，健康供体中BAG3血清浓度的图解表示。图6.分成年龄组的健康供体中和患者中的BAG3血清浓度的图解表示。图7.用于在患有心力衰竭的患者中检测BAG3蛋白的ELISA检验的ROC曲线。图8.与患有非代偿失调的心脏病的患者相比较具有心力衰竭的诊断的患者中的BAG3血清浓度的图解表示。图9. a)在存在或不存在LPS下，在用增高的剂量的可溶性重组BAG-3刺激的鼠类巨噬细胞(J774)中iNOS(诱导型一氧化氮合酶)蛋白和用于比较的对照蛋白(GAPDH)的产生，b)在相同的细胞类型中用格里斯试剂(Griess reagent)确定亚硝酸盐。附图说明图10. rBAG3蛋白与J774细胞的表面结合的共聚焦显微镜分析。专利技术详述本专利技术基于与先前关于胞内形式所描述的功能(细胞周期和凋亡的调控)相比较具有非预期的生物活性的BAG3蛋白的可溶性形式的发现例如由细胞主动分泌的该形式可激活单核细胞/巨噬细胞。发现可溶性形式还是对于某些病理状况尤其是心脏病和胰腺癌高度特异性的血清生物化学标志物。因此本专利技术的目的是BAG3蛋白的可溶性形式和在由血清组成的生物样品中验证其水平以确定上述病理情况的存在的方法。关于可溶性BAG3，其意为由细胞主动分泌的BAG3的形式，例如，如通过其与胰腺癌细胞(Panc-I)中的外来体的结合和通过其在活肿瘤细胞系的上清液中的存在(台盼蓝排除测定)所示，所述活肿瘤细胞系诸如H印G2细胞(人类肝细胞癌)、C6细胞(大鼠成胶质细胞瘤)ASPC-I细胞(人类胰腺腺癌,human pancreatic adenocarcinoma)、AR0细胞(间变性甲状腺癌)、HT-29细胞(结直肠腺癌)和完全相同的Panc-I细胞，从而显示可溶性BAG3并不通过细胞死亡后培养基中的细胞内容物的释放而产生。并且，可溶性BAG3在心肌细胞中的氧化应激的诱导后释放(或分泌)，且可例如通过SDS-PAGE从患有心脏病的患者的血清中被定量地纯化为分子量约75kD的形式。因此，在生物样品中，因为可溶性BAG3的存在独立于细胞的存在，可将其与胞浆形式相区分。 事实上，例如，发现甲状腺瘤活检中的BAG3蛋白高于正常组织中的，但免疫组织化学染色仅在胞浆中检测到该蛋白。根据可溶性BAG3作为病理状况的血清标志物的用途，本专利技术涉及通过使用单克隆抗体或多本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2009.12.04 IT MI2009A0021541.用于在未知生物样品中检测可溶性BAG3蛋白的存在和/或浓度的方法，所述方法包括以下的步骤 a.获得生物样品，所述生物样品由血清或血浆组成， b.确定所述生物样品中可溶性BAG3的存在或浓度值， c.将获自所述样品的所述值与参考值或与获自生物参考样品的值相比较， d.任选地，进一步确定相似值的分组或分成具有统计学上差异的平均值的组， e.将可溶性BAG3的存在和/水平与病理状况相关联，所述病理状况优选地选自由以下病状组成的组心脏病或胰腺癌。2.根据权利要求I所述的方法，其中所述确定步骤b)利用可溶性BAG3的特异性配体来进行。3.根据权利要求I或2中任一项所述的方法，其中所述生物样品是人类来源的。4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中将抗凝血物质添加到所述生物样品中。5.根据权利要求2-4中任一项所述的方法，其中所述特异性配体是抗体。6.根据权利要求5所述的方法，其中所述确定步骤b)通过单克隆的、多克隆的或重组的抗BAG3抗体或其片段(scFv、双抗体、微抗体)来进行。7.根据权利要求6所述的方法，其中所述抗体是单克隆的且识别选自由以下的氨基酸序列组成的组的至少一个BAG3表位BAG3的一级序列的18_33、385_399或533-547，或是其人源化的或其他通过重组修饰的重组衍生物。8.根据权利要求2-7...
【专利技术属性】
技术研发人员：玛丽亚·卡特里纳·图尔科，
申请(专利权)人：比奥尤尼沃萨有限责任公司，
类型：发明
国别省市：
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