S-腺苷甲硫氨酸甲基转移酶的测定方法及其试剂盒技术

技术编号:7835734 阅读:703 留言:0更新日期:2012-10-11 22:37
本发明专利技术公开了一种S-腺苷甲硫氨酸甲基转移酶的测定方法及其试剂盒。该检测方法是通过S-腺苷-同型半胱氨酸水解酶和腺苷脱氨酶的酶偶联反应检测SAM甲基转移酶,该检测技术不仅解除了产物的反馈抑制,结果稳定,定量反应准确,同时有效克服了放射性标记法的放射性污染问题,而且本发明专利技术由双试剂组成,可采用手工或全自动生化仪上在可见光范围内检测,使用方便,便于大量样品的快速检测。另外,本发明专利技术也同样适用于s-腺苷同型半胱氨酸水解酶和腺苷脱氨酶的酶偶联反应检测。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物化学、检验试剂领域,具体涉及的是一种S-腺苷甲硫氨酸(SAM)甲基转移酶(S-腺苷甲硫氨酸依赖的甲基转移酶)的酶偶联分析检测技术,及其基于该技术开发的检测试剂盒,该试剂盒经过改进,还分别可以制备成S-腺苷同型半胱氨酸水解酶或腺苷脱氨酶检测试剂盒。
技术介绍
生物大分子的甲基化修饰在信号传导、生物合成、蛋白修复、基因沉默和染色体表达调控等方面发挥着重要作用,S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosyl-L-methionine, SAM)是体内仅次于ATP的甲基供体,其依赖的S-腺苷甲硫氨酸转移酶利用SAM作为甲基供体,从而将DNA和蛋白质进行甲基化修饰作用,从而参与重要生理活动。目前研究表明,该酶的异常水平与老年痴呆症、抑郁症、帕金森综合症、癌症等多种疾病有关,在医学诊断方面具有重要的应用价值和临床意义。目前测定SAM甲基转移酶活力有放射性底物法、纸层析法。放射性底物法通常采用14C或3HSEAdoMet,甲基转移反应完成后,通过同位素扫描成像仪观察放射性标记的产物量,从而检测该酶的活性。该方法需要分离反应产物和底物,费时费力,重复性差,难以做到准确定量,而且反应产物S-腺苷一L-同型半胱氨酸(Hcy)对该酶催化的甲基化反应具有强烈的反馈抑制作用,导致反应不完全。另外,该方法具有有放射性,对环境及操作人员污染大。而纸层析法通常采用纸层析技术将反应底物和产物分离出来,在特定条件下检测产物的生成量,从而检测该酶的活性,该方法只能半定量检测产物的生成量,而且同样存在产 物反馈抑制,难以准确定量。目前也有专利和文献报道SAM甲基转移酶的酶偶联法测定方法。专利《一种S-腺苷甲硫氨酸(AdoMet)依赖的甲基转移酶的检测方法》申请号为201010197808. 5,该专利报道了利用重组的S-腺苷-L-高半胱氨酸核苷酶和重组的S-核糖基高半胱氨酸酶催化S-腺苷-L-高半胱氨酸反应生成高半胱氨酸,后者用Ellman试剂5,5’ -联硫-2,2’ -双硝基苯甲酸定量,从而最终测定SAM甲基转移酶的酶活。但是该方法也存在高半胱氨酸定量反应比较繁琐,工作量大,并且无法在半自动或全自动生化仪上操作的不足。
技术实现思路
本专利技术针对现有技术的上述不足,提出了一种解除了产物的反馈抑制,结果稳定可靠,定量反应准确,同时克服了放射性标记法存在的操作繁琐,费时费力,和放射性对环境及操作人员污染的不足的SAM甲基转移酶的检测方法。为了解决上述技术问题,本专利技术采用的技术方案为一种SAM甲基转移酶的检测方法,过程为通过与S-腺苷同型半胱氨酸水解酶和腺苷脱氨酶偶联,将SAM甲基转移酶的生成产物S-腺苷同型半胱氨酸迅速转化成醌化物,并在可见光范围内通过检测吸光度的变化,来确定醌化物的生成量,从而确定SAM甲基转移酶的活性。本专利技术针对上述问题,结合现有专利技术的不足,利用酶偶联反应法,提供一种可以定量、检测方便的SAM甲基转移酶酶活测定试剂盒,反应原理如下本文档来自技高网
...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种S-腺苷甲硫氨酸甲基转移酶的测定方法,其特征在于其过程为通过与S-腺苷同型半胱氨酸水解酶和腺苷脱氨酶偶联,将S-腺苷甲硫氨酸甲基转移酶的生成产物S-腺苷同型半胱氨酸迅速转化成醌化物,并在可见光范围内通过检测吸光度的变化,来确定醌化物的生成量,从而确定S-腺苷甲硫氨酸甲基转移酶的活性。2.根据权利要求I所述的S-腺苷甲硫氨酸甲基转移酶的测定方法,其特征在于S-腺苷甲硫氨酸甲基转移酶的检测过程具体为 (1)WS-腺苷甲硫氨酸上去除甲基基团,生成S-腺苷同型半胱氨酸; (2)S-腺苷同型半胱氨酸快速被S-腺苷-L-同型半胱氨酸水解酶分解为L-同型半胱氨酸和腺嘌呤核苷; (3)腺嘌呤核苷被腺苷脱氨酶转化为次黄嘌呤核苷,次黄嘌呤核苷在嘌呤核苷磷酸化酶的作用下生成次黄嘌呤; (4)次黄嘌呤在黄嘌呤氧化酶的作用下快速生成过氧化氢和尿酸; (5)接下来就是特异性较强的Trinder反应以TOOS为色原、过氧化氢和4-氨基安替比林的在过氧化物酶的作用下生成醌化物,且在546nm波长下有吸收,醌化物吸光度和过氧化氢的产生浓度呈正比,即与S-腺苷甲硫氨酸甲基转移酶的活力呈正比,从而通过吸光度的变化来检测S-腺苷甲硫氨酸甲基转移酶的酶活。3.—种权利要求I或2所述的S-腺苷甲硫氨酸甲基转移酶的测定方法所用的测定试剂盒,其特征在于该试剂盒具体由试剂I和试剂2组成的,其中 试剂I为 .20 200mmol/L缓冲液 .10 200mmol/L MgCl2 I 100mmol/L S-腺苷甲硫氨酸 I 10Ommol /I,三憐酸腺苷 I 10...

【专利技术属性】
技术研发人员:邹炳德邹继华贾江花章玉胜
申请(专利权)人:宁波美康生物科技股份有限公司
类型:发明
国别省市:

网友询问留言 已有0条评论
  • 还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。

1