本发明专利技术属于蛋白酶基因工程技术领域，具体涉及一种耐有机溶剂蛋白酶，具体涉及其突变基因及其编码的蛋白质。从序列表的SEQ?ID?NO：1或SEQ?ID?NO：3可见，本发明专利技术所述耐有机溶剂碱性蛋白酶在原核苷酸序列的第385或第436发生了定点突变，即其成熟肽段的第24位突变氨基酸为谷氨酸或者谷氨酰胺；第41位氨基酸为丙氨酸或者赖氨酸。突变后的四种编码后的蛋白质的有机溶剂，特别是亲水性有机溶剂的耐受性明显大大加强。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于蛋白酶基因工程
，具体涉及一种耐有机溶剂蛋白酶，具体涉及其突变基因及其编码的蛋白质。技术背景蛋白酶是指能催化肽键水解的一类酶，自1914年被试验用于洗涤剂的添加成分以来，由于具有重要的商业用途而被广泛关注。当今蛋白酶的产量占据酶市场的40%以上，广泛应用与洗涤剂、食品、制药、制革、诊断试剂、污水处理等领域。蛋白酶广泛存在于动物、植物、真菌及原核生物等所有生物中，其中微生物来源的蛋白酶占据目前蛋白酶生产总量的2/3以上。微生物来源的蛋白酶又可根据酶的反应pH、活性基团的特征等分为金属蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶和丝氨酸蛋白酶等。蛋白酶催化的最普遍的反应是水解蛋白质中的肽键。通常情况下，蛋白酶催化水解肽键的反应是在特定的PH的缓冲液中进行的，而且蛋白酶对其所催化肽键的氨基酸残基具有特异性要求，即有着高度的区域选择性和立体选择性。随着酶工程和溶剂工程技术的发展，人们发现蛋白酶在有机溶剂中能够在有机溶剂中能催化一些水溶液中不能进行的反应。如，1984年，Klibanov等人发现蛋白酶在一些有机溶剂中保存较长时间仍然具有活性，而且可以催化合成肽键的反应。大量研究表明，有机溶剂中进行酶促反应有着许多的优点1、增大各种有机底物在溶剂中，特别是在亲水性有机溶剂中的溶解度，提高反应效率；2、具有高度的立体选择性和区域选择性，有机介质可改变选择性；3、控制反应平衡向所需方向移动，如水解酶在有机介质中能催化脱水缩合反应；4、有效防止微生物污染，产物易于分离纯化等。这一发现促进了非水酶学的兴起。如本研究室利用自行筛选到的耐有机溶剂蛋白酶在亲水性有机溶剂二甲基亚砜(DMSO)中实现了甜味剂Aspartame的前体和内吗啡呔I的合成，产率达到90%以上，而且在实现了底物与产物的反应分离耦合，大大提高了产率，简化了产物的分离纯化。说明在亲水性有机溶剂体系中进行酶催化反应的市场前景是非常巨大的。有机溶剂体系中酶催化的诱人前景与酶易失活的矛盾推动了酶的改造与非水酶学的发展。过去20多年，研究者致力于提高酶在有机溶剂中的稳定性，常用方法1、使用疏水性有机溶剂作为反应介质并控制介质中的含水量，以保证酶的“必需水” ;2、在反应介质中加入保护剂甘油、乙二醇、多元醇聚合物等，或加入环糊精等冷冻干燥保护剂，以提高酶分子在有机介质中的稳定性。3、利用固定化、包埋法、大分子修饰等理化修饰方法提高酶在有机介质中的活性和稳定性；4、利用基因改造提高酶的有机溶剂稳定性。例如，Arnold小组利用易错PCR定向改造枯草杆菌蛋白酶(Subtilisin),提闻其在有机相中的活力，对编码该蛋白酶成熟肽的DNA片段进行突变，并筛选得到在高浓度二甲基甲酰胺(DMF)中酶活性明显提高的突变株，其中突变体PC3在60%和85%的DMF中的酶活力分别是天然酶的256和131倍。此后再在PC3的基础上进行突变，得到的突变体13M酶活力比PC3还要高3倍。虽然近年来在利用基因改造提高酶的有机溶剂稳定性方面取得了一定的进展，但往往出发酶的有机溶剂耐受性相对较低，有机溶剂耐性，特别是在亲水性的有机溶剂中提高的幅度不大，对工业应用还有一定的差距。
技术实现思路
本专利技术的技术目的在于提供一种高耐有机溶剂碱性蛋白酶的突变基因，使得本专利技术所述的这种蛋白酶相对于现有技术的同类蛋白酶而言，其有机溶剂，特别是亲水性有机溶剂的耐受性进一步大大提高。为了实现本专利技术的技术目的，本专利技术的技术方案在于 一、一种耐有机溶剂碱性蛋白酶，其特征在于其具有SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列，其氨基酸序列示于SEQ ID NO :2 ;或者其具有SEQ ID NO :3所示的核苷酸序列，其氨基酸序列示于 SEQ ID NO 4o本专利技术所述的耐有机溶剂碱性蛋白酶基因的出发原始蛋白酶基因来自于中国专利申请(专利申请公开号CN101215534A)所述的耐有机溶剂碱性蛋白酶基因，其核苷酸序列如本专利技术序列表SEQ ID NO 5所示。从序列表的SEQ ID NO :1或SEQ ID NO :3可见，本专利技术所述耐有机溶剂碱性蛋白酶在原核苷酸序列的第385或第436发生了定点突变，即其成熟肽段的第24位突变氨基酸为谷氨酸或者谷氨酰胺；第41位氨基酸为丙氨酸或者赖氨酸。突变后的四种编码后的蛋白质的有机溶剂，特别是亲水性有机溶剂的耐受性明显大大加强。二、本专利技术所述耐有机溶剂碱性蛋白酶基因的克隆及制备方法，包括如下步骤。(I)选用专利申请公开号 CN101215534A 中所述licheniformi YPlA(CCTCC NO: M207021)耐有机溶剂碱性蛋白酶编码基因的克隆方法克隆编码耐有机溶剂碱性蛋白酶基因，同时根据subti I is 168中p43启动子的基因序列(GenBank号K02714)设计引物扩增ρ43启动子，用重叠PCR的方法把启动子ρ43和上述耐有机溶剂碱性蛋白酶基因连接，最后与表达载体ΡΗΥ300 (由南京农业大学李顺鹏教授惠赠)连接，转化枯草芽孢杆菌宿主WB800 (由南京农业大学李顺鹏教授惠赠)，构建好重组菌WB800-pHY300-p43-YP IA 进行表达。(2)选用构建好的基因工程菌WB800-pHY300-p43-YPlA于37°C摇床培养过夜，提取质粒作为定向进化的模板。(3)根据易错滚环复制的原理，设计3’末端硫代修饰的六聚体引物5’ -NpNpNpNpsNpsN-3’。(4)以获得的质粒DNA为模板，用Φ 29 DNA聚合酶(Fermentas #EP0097)进行易错滚环复制扩增，程序如下95°C变性3min ;迅速置冰上冷却至室温；30°C反应24 h。(5)反应产物用Dpn I酶(Fermentas #ER1701)消化I h，进行胶回收浓缩。(6)胶回收产物转化枯草杆菌WB800，涂布牛奶平板进行初筛。(7)选择有透明圈的突变株进行摇瓶培养7天，离心取上清液即为粗酶液，进行有机溶剂耐受性复筛，发现命名为K8和P8的突变株在50% (v/v)的DMF中的酶活力分别是原始酶的2. 29和I. 88倍；而命名为Z8和Z25的突变株在50% (v/v)的DMF中的酶活力分别是原始酶的I. 76和I. 8倍，如表二。(8)对步骤(7)所述的突变株的主要性质进行了研究，发现四种突变体最适反应PH值，pH值稳定性都没有发生明显变化；三种突变体P8、Z8、Z25的最适反应温度和温度稳定性也没显著改变；而1(8的最适反应温度和温度稳定性都有所提高了 ；突变株在各种有机溶剂中的稳定性都有显著的提高。核苷酸及氨基酸分析发现，突变基因与YPlA基因相比，分别从起始密码子后385 bp (K8/P8)和436 bp (Z8/Z25)处发生了突变，在第385位分别从GCG突变为CAG和GAG ;氨基酸分别从Ala突变为Gln和Glu ;从GAC突变为GCA和AAG ；氨基酸从Asp突变为Ala和Lys。三、本专利技术所述耐有机溶剂碱性蛋白酶在有机溶剂中催化合成小肽中的应用。本专利技术的有益效果在于 (I)本专利技术从天然耐有机溶剂碱性蛋白酶出发，通过定向进化的手段对其基因改造，获得了四个各种有机溶剂，特别是亲水性有机溶剂耐受性更强的突变基因，突变株在50% (v/V)亲水性本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1. 一种耐有机溶剂碱性蛋白酶，其特征在于其具有SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列，其氨基酸序列示于SEQ ...
【专利技术属性】
技术研发人员：何冰芳，苏龙，吴斌，
申请(专利权)人：南京工业大学，
类型：发明
国别省市：
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