本发明专利技术属于基因工程研究领域，涉及一种耐有机溶剂蛋白酶的突变体。本发明专利技术所述的五个突变改造的蛋白酶是由具有氨基酸序列为SEQIDNo.1的来源于铜绿假单胞菌的蛋白酶中氨基酸残基取代而产生的，所述的氨基酸突变包括第46、224位的取代。本发明专利技术公开了优选的分子改造的耐有机溶剂性能增强的蛋白酶、相应的氨基酸序列及其应用。本发明专利技术所述的五个突变体蛋白酶在有机溶剂中的稳定性方面更加优良，在多种有机溶剂体系中催化二肽合成的效率比野生型的显著提高。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于基因工程研究領域，涉及耐有机溶剂蛋白酶的突变体，具体的是通过基因工程改造得到的在有机溶剂中具有高稳定性的蛋白酶。
技术介绍
生物催化技术广泛用于制药、精细化工等合成领域，然而通常反应所用的底物或中间体水溶性差，因此在非水介质中的酶催化反应是推动该领域发展的关键技木。而多数酶在有机溶剂中不稳定、易失活，如何提高酶分子在有机溶剂中的稳定性成为了关键瓶颈。现有技术对在有机溶剂中进行酶催化的研究着重于酶催化介质工程、酶的物理化学修饰及固定化等技术，往往难以高效地改善酶的有机溶剂稳定性及催化反应效率，挖掘和开发在有机溶剂中具有高活性及高稳定性的酶类是十分迫切的，可提升生物催化工程的关键理论与技术。Arnold 等(J. Am. Chem. Soc. 113，6336-6337)对 a -裂解蛋白酶表面四个带电氨基酸残基进行定点饱和突变，获得的多个突变体在84%DMF中稳定性提高。Rhee等(Biochim. Biophys. Acta. -Protein Struct. Mol. EnzymoI. 1547, 370-378)通过定向进化技术获得了磷脂酶Al的三个突变体(SA8、SA17及SA20)在50%DMS0中的半衰期约是野生型的4倍。Reetz (Chem. Commun. 46，8657-8658)基于迭代饱和突变技术获得的枯草杆菌脂肪酶突变体在こ腈、DMSO及DMF等有机溶剂中的稳定性显著提高。Dalfard等(J.Biochem. 148, 231-238)通过定点突变提高了 Salinivibrio /Troteoスバ■来源的蛋白酶在多种有机溶剂中的稳定性，降低了其在有机相中的热失活速率。以上现有技术的文献显示出蛋白质分子改造手段对于提高酶在有机溶剂中的稳定性具有突出的优势，然而在实验水平上还没有成熟的相关理论报道，更没有可借鉴的分子改造方法。而运用定向进化策略对酶稳定性进行改造研究具有较高的可行性。近年来蛋白酶在有机相中的反应多样性越来越受到人们的关注，其可进行合成小肽合成、糖轭合物，转酯反应以及动力学拆分等，在医药中间体、日用品、化妆品、生物材料等领域具有广泛的应用前景。然而大多数蛋白酶在有机相中也容易失活，因此，提高蛋白酶在有机相中的稳定性对于推动蛋白酶非水相生物催化应用的发展具有突出的意义。
技术实现思路
本专利技术的技术目的在于对本专利技术人团队在先授权专利的蛋白酶进行定向进化，以得到在有机溶剂中具有更高稳定性的蛋白酶；本专利技术的另ー个技术目的在于提供该酶在有机相中催化小肽合成的应用，为有机相肽合成的エ业化进程进一歩提供基因资源。一、本专利技术通过定向进化技术对铜绿假单胞菌来源的耐有机溶剂蛋白酶PT121基因(见授权中国申请，授权公告号CN 101240254 B)进行分子改造，使改造后的蛋白酶的突 变体在有机溶剂稳定性方面更加优良。该耐有机溶剂蛋白酶突变体是通过用另一种氨基酸残基取代在由SEQ ID No: I表示的氨基酸序列的蛋白酶的下述位置、或其相应位置上的氨基酸残基而获得的蛋白酶突变体，且所述的氨基酸残基位置为SEQ ID No:l中的第46位，和/或第224位；其在有机溶剂中稳定性比原出发蛋白酶大大提高。其中，所述的SEQ IDNo: I是在先授权专利CN 101240254 B中所述的铜绿假单胞菌aeruginosa)PT121所产的蛋白酶的成熟肽部分，编码301个氨基酸。进ー步地，所述的蛋白酶突变体是通过用另ー种氨基酸残基取代在由SEQ IDNo: I表示的氨基酸序列表现出至少90%同源性的氨基酸序列的蛋白酶的下述位置、或其相应位置上的氨基酸残基而获得的蛋白酶突变体，且所述的氨基酸残基位置为SEQ ID No: I中的 第46位，和/或第224位；其在有机溶剂中稳定性比原出发蛋白酶大大提高。更进一歩地，所述的蛋白酶突变体是通过用另ー种氨基酸残基取代在由SEQ IDNo: I表示的氨基酸序列表现出至少99%同源性的氨基酸序列的蛋白酶的下述位置、或其相应位置上的氨基酸残基而获得的蛋白酶突变体，且所述的氨基酸残基位置为SEQ ID No: I中的第46位，和/或第224位；其在有机溶剂中稳定性比原出发蛋白酶大大提高。更进一歩地，所述的另一种氨基酸残基优选自下述的氨基酸 第46位酪氨酸(氨基酸縮写名称为Y);第224位苯丙氨酸(氨基酸縮写名称为F)或酪氨酸(氨基酸縮写名称为Y)。ニ、编码本专利技术所述的蛋白酶突变体的基因。其出发蛋白酶的基因序列參见在先授权中国专利CN 101240254 B所对应的蛋白酶成熟肽段编码的核苷酸序列。在该蛋白酶的第46位和第224位突变点对应的编码的核苷酸编码，另理解为本专利技术所述的“另ー种氨基酸残基”所编码的核苷酸编码。三、包含本专利技术第二点所述基因的重组载体，以及包含所述重组载体的转化体(例如本专利技术所述的微生物)。本专利技术所述的重组载体，应理解为现有技术中任意的基因的重组载体，例如各种质粒，即将蛋白酶突变体的突变基因导入能使该蛋白酶突变体稳定的表达DNA载体质粒。 而所述的重组载体的转化体，即指重组载体的宿主细胞，例如，本专利技术实施例2所述的微生物^: coli BL21的宿主细胞；当然，现有技术常用的宿主细胞的微生物包括革兰氏阳性细菌如枯草芽孢杆菌，革兰氏阴性细菌如大肠杆菌，放线菌如链霉菌，酵母如酿酒酵母，真菌如曲霉菌，它们的细胞均是常用的重组载体的宿主细胞。四、利用本专利技术所述的蛋白酶突变体在非水体系中催化小肽合成反应的应用以Cbz-Gly-OH和L-Phe-NH2为底物，本专利技术所述的蛋白酶突变体溶解在pH8. 0的Tris-HCl中，与等体积的有机溶剂混合，在30°C保温反应。本专利技术所述的蛋白酶突变体在50% (v/v)こ腈体系中催化ニ肽Cbz-Gly-Phe-NH2合成的效率比野生型提高了 29. 9 106. 7%，在50% (v/v) DMF、甲醇、こ醇体系中的合成效率也有显著的提高，以上结果进一步提高了蛋白酶PT121エ业化应用的可行性。附图说明图I制备的蛋白酶突变体的SDS-PAGE电泳分析。图2蛋白酶PT121及其突变体在こ腈中的稳定性曲线。图3蛋白酶PT121及其突变体在丙酮中的稳定性曲线。具体实施例方式本专利技术所述的生物材料的来源的一般性说明 I、由SEQ ID No: I表示的氨基酸序列的蛋白酶授权中国申请，授权公告号CN101240254 B。2、引物设计及制备本专利技术中所使用的引物均由上海Invitrogen公司合成制备。3、实验中所使用的pET22b(+)质粒购自于Novagen公司，而所使用的LA Taq DNA聚合酶、PrimeSTAR HS高保真酶、限制性内切酶及T4连接酶等均购自于TaKaRa公司，使用的DNA胶回收试剂盒及质粒小提试剂盒均购自于Axygen公司。实施例I :含蛋白酶PT121编码序列的重组质粒PPT121的构建 采用酹-氯仿法抽提aeruginosa PT121菌株的总DNA。根据其所分泌的 耐有机溶剂的蛋白酶PT121的基因序列，在去除信号肽的剩下的基因(编码前肽及成熟肽)的两端设计引物，扩增耐有机溶剂蛋白酶PT121的编码基因。设计的引物为 PTl 21—F: GCGGCCATGGTA本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种蛋白酶突变体，是通过用另一种氨基酸残基取代在由SEQ ID No: I表示的氨基酸序列的蛋白酶的下述位置、或其相应位置上的氨基酸残基而获得的蛋白酶突变体，且所述的氨基酸残基位置为SEQ ID No: I中的第46位，和/或第224位；其在有机溶剂中稳定性提闻。2.一种蛋白酶突变体，是通过用另一种氨基酸残基取代在由SEQ ID No: I表示的氨基酸序列表现出至少90%同源性的氨基酸序列的蛋白酶的下述位置、或其相应位置上的氨基酸残基而获得的蛋白酶突变体，且所述的氨基酸残基位置为SEQ ID No:l中的第46位，和/或第224位；其在有机溶剂中稳定性提高。3.一种蛋白酶突变体，是通过用另一种氨基酸残基取代在由SEQ ID No: I表示的氨基酸序列表现出至少99%同源性的氨基酸序列的蛋白酶的...
【专利技术属性】
技术研发人员：何冰芳，庄宇，朱富成，吴斌，
申请(专利权)人：南京工业大学，
类型：发明
国别省市：
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