纯化活性GLA结构域凝固蛋白的方法技术

本发明专利技术涉及纯化生物学活性的GLA结构域凝固蛋白的方法，包括下列步骤：a)使含有一种或多种GLA结构域凝固蛋白，并可能含有GLA结构域蛋白的生物学无活性分子的样品与亲和支持物接触，所述亲和支持物上固定了特异性结合至少一种生物学活性的GLA结构域凝固蛋白的核酸适配体，从而在(i)所述核酸适配体和(ii)所述GLA结构域凝固蛋白之间形成复合物，b)从步骤a)形成的复合物中释放GLA结构域凝固蛋白，和c)以纯化的形式回收所述生物学活性的GLA结构域凝固蛋白。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】纯化活性GLA结构域凝固蛋白的方法专利技术名称纯化活性GLA结构域凝固蛋白的方法专利
本专利技术涉及蛋白质纯化领域，特别涉及GLA结构域凝固蛋白，甚至更具体地活性的GLA结构域凝固蛋白纯化的领域。现有技术一般而言，GLA结构域蛋白形成具有共同结构——GLA结构域的蛋白质家族，所述GLA结构域由位于这些蛋白质N末端的区域组成并且包含多个谷氨酰胺残基，所述谷氨酰胺残基特别被羧化以产生羧基谷氨酸或“GLA”残基。GLA结构域蛋白一般包含被称为前肽的N端部分，该部分被维生素K依赖性的羧化酶识别。在GLA结构域的谷氨酰胺残基羧化后，前肽被蛋白水解切割并释放成熟和活性的GLA结构域蛋白。根据考虑的蛋白质，GLA结构域由约45个氨基酸组成，所述氨基酸包含通常被羧化产生Gla的9至12个谷氨酰胺残基。GLA结构域蛋白由“维生素K依赖性”的蛋白质组成。GLA结构域蛋白涵盖了凝固因子、骨组织蛋白和芋螺肽(conopeptides)。GLA结构域凝固因子涵盖了凝血酶原(因子II)、因子VII、因子IX、因子X、蛋白C和蛋白S。GLA结构域骨组织蛋白涵盖了骨钙蛋白和基质Gla蛋白。GLA结构域芋螺肽涵盖了芋螺毒素(conantokin)G和芋螺毒素T。GLA结构域蛋白还涵盖了其他蛋白质，例如蛋白Z、Gas6、PRGP1和PRGP2。由Furie等人在文章(1999，Blood，卷93：1798-1808)中特别介绍了GLA结构域蛋白。维生素K依赖性的GLA结构域凝固蛋白由有治疗性兴趣的蛋白质组成。在所述蛋白质中，因子II、因子VII、因子IX和因子X代表具有极大治疗性兴趣的蛋白质，所述蛋白质被施用于多种内稳态病症的预防和治疗。能够从天然的人体液中(一般是从人血浆中)纯化人GLA结构域凝固蛋白。此外，为了开发生产和纯化重组人GLA结构域凝固蛋白的方法，已进行了大量研究。例如可提及已作为药物销售的重组人因子VII。应理解获得其中的目标凝固因子处于生物学活性形式的纯化制备物具有极大重要性，因为所述凝固因子是用作药物活性成分的物质。应特别提及的是，在体外通过遗传转化的细胞的手段，或者在体内通过转基因动物的手段，而获得以重组蛋白形式生产的GLA结构域凝固因子的纯化制备物，对此而言，选择在人工系统或与人异源的系统中生产的这些重组因子的生物学活性形式是必需的。对于获得从生物液体中纯化的GLA结构域蛋白(其中这些蛋白质是天然或另外以重组蛋白质形式产生的)而言，合适的纯化方法是现有技术中已知的。这些方法一般包括基于蛋白质沉淀和通过层析支持物步骤的一系列的选择性分离步骤，随后是顺序洗脱步骤、深层过滤步骤、超滤，或者其他浓缩步骤。目前用于生产药物的纯化GLA结构域凝固蛋白的方法不包括亲和层析步骤。此类技术选择的一个原因在于这样的缺陷，所述缺陷是由于移植到亲和支持物上的配体分子一部分脱离造成的，发现所述脱离与层析洗脱物体积中的纯化的治疗性蛋白质相关联。作为示例，可提及产品这是基于纯化的人因子IX的药物组合物，所述人因子IX是通过使用在其上固定小鼠抗FIX单克隆抗体的免疫亲和支持物的方法获得的。然而，产品的专题文章说明在最终产品中存在痕量的鼠抗人FIX单克隆抗体，所述抗体能够在受治疗的患者体内导致免疫原性问题，因为患者变得对“可滤物(leachables)”(鼠抗体和抗体片段)免疫。产品的专题文章说明对鼠蛋白质过敏的患者的禁忌症。现有技术中已知，GLA结构域凝固蛋白(包括凝血酶原、因子VII、因子IX、因子X、蛋白C和蛋白S)的部分或完整的GLA结构域对维持其生物学活性是重要的。因此，现有技术需要用于纯化活性GLA结构域凝固蛋白的改善的或备选的方法。这涵盖了用于获得包含单一纯化的活性蛋白质(例如因子VII或因子IX)的组合物的备选或改善的方法的需求，和用于获得包含活性GLA结构域蛋白的组合的组合物(例如包含活性因子II、活性因子VII、活性因子IX和活性因子X的组合的组合物)的备选的或改善的方法的需求。这涵盖了用于纯化非重组的活性GLA结构域蛋白或重组的活性GLA结构域蛋白的备选或改善的方法的需求。专利技术概述本专利技术涉及用于纯化生物学活性的GLA结构域凝固蛋白的方法，所述方法包括下列步骤：a)使含有一种或多种GLA结构域凝固蛋白并可能含有GLA结构域蛋白的生物学无活性分子的样品与其上固定有与至少一种生物学活性的GLA结构域凝固蛋白特异性结合的核酸适配体的亲和支持物接触，从而在(i)所述核酸适配体和(ii)所述活性GLA结构域凝固蛋白之间形成复合物，b)从步骤a)形成的复合物中释放活性的GLA结构域凝固蛋白，和c)以纯化的形式回收所述生物学活性的GLA结构域凝固蛋白。在上述方法中，所述适配体优选是脱氧核糖核酸适配体。在上述方法中，所述GLA结构域凝固蛋白可以是维生素K依赖性的凝固因子，例如选自因子II、因子VII、因子IX、因子X、蛋白C和蛋白S。在这些方法的某些实施方案中，所述核酸适配体由序列SEQIDNO.4的适配体组成。附图简介图1显示了在根据表面等离振子共振技术的测定中，(i)在多种组合物中存在的因子IX与(ii)特异性针对固定在支持物上的GLA结构域蛋白的适配体之间的结合曲线。沿x轴：时间，按秒表示；沿y轴：共振信号，按任意共振单位表示。1号曲线：由惠氏公司(Wyeth)以名称出售的重组FIX；2号曲线：由转基因猪生产的重组因子IX的半纯化制备物(FIXtg)。该FIX是低γ羧基化的(在存在的12个中，羧基化量度＜7个γ羧基化)；3号曲线：阴性对照(仅缓冲液)。图2是人血浆因子IX的纯化级分中，或因子IX的转基因猪的乳汁中含有的蛋白质的SDS-PAGE电泳凝胶的图像，所述蛋白质已经过预处理，所述预处理是通过澄清、然后在MEP支持物上层析，然后在移植了特异性针对GLA结构域蛋白的核酸适配体的亲和支持物上层析。用考马斯蓝处理SDS-PAGE凝胶。从左至右：第1道：起始组合物：来自人因子IX的转基因猪的乳汁，其经过了通过澄清然后在MEP支持物上层析的预处理；第2道：未滞留在亲和支持物上的级分中含有的蛋白质；第3道：洗脱级分中含有的蛋白质；第4道：来自亲和支持物的输出物中、再生缓冲液中含有的蛋白质；第5道：人血浆因子IX的纯化级分；6道：已知分子量的参照蛋白质。标出了参照蛋白质的某些蛋白质条带的表观分子量。图3是人血浆因子IX的纯化级分中，或人因子IX的转基因猪的乳汁中含有的蛋白质的SDS-PAGE电泳凝胶的图像，所述蛋白质已经过预处理，所述预处理通过澄清、然后在MEP支持物上层析、然后在移植了特异性针对GLA结构域蛋白的核酸适配体的亲和支持物上纯化。用硝酸银处理SDS-PAGE凝胶。图4A代表了染色后整个SDS-PAGE凝胶。图3B是图3A的凝胶的细节部分。“St”和“S”道：已知分子量的参照蛋白质；第1、2和4道：在不同测定后，在MEP支持物上层析，然后在其上移植了特异性针对GLA结构域蛋白的核酸适配体的亲和支持物上纯化后洗脱级分中含有的蛋白质；第3道：人血浆因子IX的纯化级分(在SDS-PAGE凝胶上样的25ng因子IX)；第3’道：人血浆因子IX的纯化级分(在SDS-PAGE凝胶上样的550ng因子IX)。图3A和图3B中标出了某些蛋白本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2009.07.31 FR 09554131.纯化活性GLA结构域凝固蛋白的方法，其包括下列步骤：a)将含有一种或多种GLA结构域凝固蛋白以及可能含有GLA结构域蛋白的生物学无活性分子的样品与亲和支持物接触，所述亲和支持物上固定了特异性结合多种生物学活性的GLA结构域凝固蛋白的核酸适配体，从而在(i)所述核酸适配体和(ii)所述活性GLA结构域凝固蛋白之间形成复合物，b)从步骤a)中形成的复合物释放活性GLA结构域凝固蛋白，和c)以纯化的形式回收所述生物学活性的GLA结构域凝固蛋白，其中所述核酸适配体由具有选自序列SEQIDNO：3、4和6至39的序列的适配体组成。2.权利要求1中所述的方法，其特征是所述核酸适配体由脱氧核糖核酸适配体组成。3.权利要求1所述的方法，其特征是所述核酸适配体包括在下列通式(I)的化合物的结构中：[IMM]x-[SPAC]y-[APT](I)，其中：-[IMM]表示用于在支持物上固定的化合物，-[SPAC]表示间隔区链，-[APT]表示特异性结合活性G...

【专利技术属性】
技术研发人员：G·佩雷，N·比霍罗，L·塞列特，
申请(专利权)人：LFB生物技术公司，
类型：发明
国别省市：