本发明专利技术公开了包含运动抑制剂的精子细胞悬浮液。此类悬浮液中含有的细胞更能耐受与将精子细胞分选为性别富集群过程一般相关的多个步骤，从而使分选后的组合物中活精子或运动性的精子数目增多。本发明专利技术也公开了形成此类细胞悬浮液的方法以及对精子细胞染色的方法。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术主要涉及分选精子细胞的方法。更具体而言，本专利技术涉及制备精子细胞运动性相对于体内射精精子降低的悬浮液，更具体而言是运动性暂时降低；所述悬浮液可用于如将精子细胞分选为带有X或Y染色体的富集精子细胞群的方法。
技术介绍
通过人工授精(Al)使动物受精以及体外受精后的胚胎移植已经是一项成熟的技术。在家畜产业中，能够对繁殖结果施加影响而使其后代具有一种或多种所需特征，有明显的优势。例如，乳制品产业中如能预先选择后代有利于雌性而保证奶牛的产量，则会带来经济效益。将精子分离为富集的带有X和Y染色体的细胞群，即所谓的性别富集精液或性别富集精子，便是达到后代预选目的的方法之一。为得到性别富集精液，必须将精子细胞以染料染色，然后分选为带有X和Y染色体的细胞。染色和分选过程的每一步对于精子细胞而言都是应激，会导致精子细胞的存活力或运动性，特别是前向性运动性降低。Salisbury等人描述了将公牛射出的精液直接收集至稀释液中的技术，所述稀释液可抑制细胞的运动性并防止其从周围精浆中吸收糖。当收集射出精液至稀释液中，且通过充气100%的CO2替换液体上方的气相时，射出精液内的细胞会丧失运动性。只要将细胞留存于该稀释液中且排除空气，就可以保证其在室温下数小时不运动，而在5°c时可维持至少8天。专利技术概沭本专利技术的多方面之一涉及精子悬浮液，所述精子悬浮液可用于如将精子分选为带 X或Y染色体的富集精子群的方法。因此简言之，本专利技术涉及含有活精子以及下调精子糖摄取的组合物的精子细胞悬浮液，所述悬浮液中的精子浓度小于约IX IO6精子/ml或至少为IX IO8精子/ml。本专利技术还涉及含有不运动活精子的精子细胞悬浮液，所述悬浮液中的精子浓度小于约I X IO6精子/ml或至少为I X IO8精子/ml。本专利技术还涉及含有活精子的精子细胞悬浮液，所述精子相对于同一种系体内射出的精子更具附睾中精子的运动性特点，所述悬浮液中的精子浓度小于约IXio6精子/ml或至少为I X IO8精子/ml。本专利技术还涉及含有活精子、钾、并任选地含有钠的精子细胞悬浮液，所述悬浮液中的精子浓度至少为IX IO8精子/ml，而钾与钠的摩尔比大于各I : I。本专利技术还涉及含有活精子、下调精子糖摄取的组合物、以及DNA选择性染料的精子细胞悬浮液。4本专利技术还涉及含有不运动活精子和DNA选择性染料的精子细胞悬浮液。本专利技术还涉及含有活精子和DNA选择性染料的精子细胞悬浮液，所述精子相对于同一种系体内射出的精子，其代谢率和运动性更具附睾中精子的特点。本专利技术还涉及含有不运动活精子的精子细胞悬浮液，所述精子的DNA上结合有 DNA选择性染料。本专利技术还涉及含有活精子的精子细胞悬浮液，相对于同一种系体内射出的精子而言，所述精子代谢率和运动性更具附睾中精子的特点，且其DNA上还结合有DNA选择性染料。本专利技术还涉及对精子细胞染色的方法，所述方法包括形成这样的染色混合物，其含有完整的活精子细胞、运动抑制性量的钾，以及DNA选择性染料。本专利技术还涉及形成用于流式细胞术方法的精子细胞悬浮液的方法，所述方法包括将精子细胞源与抑制精子细胞运动性的组合物混合，以形成精子细胞悬浮液，所述悬浮液中精子细胞浓度小于约I X IO6精子细胞/ml或至少为I X IO8精子细胞/ml。本专利技术还涉及形成用于流式细胞术方法的精子细胞悬浮液的方法，所述方法包括将哺乳动物射出精液收集至含有抑制性量的运动抑制剂的缓冲液中以形成精子悬浮液，所述悬浮液中含有精子浓度小于约I X IO6精子细胞/ml或至少为I X IO8精子细胞/ml。本专利技术的其它方面和特征是显而易见的，部分将于后文说明。附图简沭图I以图表显示了实施例I中进行研究的结果,其中测量了于28°C含IOmM丙酮酸盐的TCA或二氧化碳气层包裹的含IOmM丙酮酸盐的TCA中，用600 μ M Hoechst 33342染料染色的精子细胞的前向性运动百分比。图2以图表显示了实施例I中进行研究的结果，其中测量了于28°C含有IOmM丙酮酸盐的TCA或pH 7. 3基于碳酸盐的抑制剂中，用600 μ MHoechst 33342染料染色的精子细胞的前向性运动百分比。图3以图表显示了实施例I中进行研究的结果，其中测量了于28°C含有IOmM丙酮酸盐的TCA或pH 6. 2基于碳酸盐的抑制剂中，用600 μ MHoechst 33342染料染色的精子细胞的前向性运动百分比。图4以图表显示了实施例2中进行研究的结果，其中测量了于28°C含IOmM丙酮酸盐的TCA且随后用含有IOmM丙酮酸盐的TCA或pH 6. 2基于碳酸盐的抑制剂I比3稀释的情况下，用ΙΟΟΟμΜ Hoechst 33342染料染色的精子细胞的前向性运动百分比。图5以图表显示了实施例2中进行研究的结果，其中测量了于28°C (I)含有IOmM 丙酮酸盐的TCA且用相同溶液I比3稀释的情况下或(2)pH 7. 3基于碳酸盐的缓冲液且用 pH 6. 2基于碳酸盐的抑制剂I比3稀释的情况下，用1000 μ M Hoechst 33342染料染色的精子细胞的前向性运动百分比。图6以图表显示了实施例2中进行研究的结果，其中测量了于28°C含有IOmM丙酮酸盐的TCA或pH 6. 2基于碳酸盐的抑制剂中，用1000 μ MHoechst 33342染料染色的精子细胞的前向性运动百分比。图7以图表显示了实施例3中进行研究的结果，其中测量了于41°C含有IOmM丙酮酸盐的TCA且随后用含有IOmM丙酮酸盐的TCA或pH6. 2基于碳酸盐的抑制剂I比3稀释的情况下，用300μΜ Hoechst 33342染料染色的精子细胞的前向性运动百分比。图8以图表显示了实施例3中进行研究的结果，其中测量了于41°C⑴含有IOmM 丙酮酸盐的TCA且用相同溶液I比3稀释的情况下或(2)pH 7. 3基于碳酸盐的缓冲液且用 pH 6. 2基于碳酸盐的抑制剂I比3稀释的情况下，用300 μ M Hoechst 33342染料染色的精子细胞的前向性运动百分比。图9以图表显示了实施例3中进行研究的结果，其中测量了于41°C含有IOmM丙酮酸盐的TCA或pH 6. 2基于碳酸盐的抑制剂中，用SOOyMHoechst 33342染料染色的精子细胞的前向性运动百分比。附图说明图10以图表显示了实施例4中进行研究的结果，其中测量了于41°C TCA缓冲液或含有IOmM丙酮酸盐的TCA缓冲液中，用400 μ M Hoechst33342染料染色的精子的前向性运动百分比。图11以图表显示了实施例5中进行研究的结果，其中测量了于41°C TCA缓冲液或含有10 μ M维生素K的TCA缓冲液中，用400 μ M Hoechst33342染料染色的精子的前向性运动百分比。图12以图表显示了实施例6中进行研究的结果，其中测量了于41°C TCA缓冲液或含有100 μ M维生素K的TCA缓冲液中，用400 μ M Hoechst33342染料染色的精子的前向性运动百分比。图13以图表显示了实施例7中进行研究的结果，其中测量了于41°C TCA缓冲液或含ImM硫辛酸的TCA缓冲液中，用400 μ M Hoechst 33342染料染色的精子的前向性运动百分比。图本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
...
【专利技术属性】
技术研发人员：C·L·路德维格，K·S·克劳利，C·N·格拉维斯，
申请(专利权)人：英格朗公司，
类型：发明
国别省市：
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