本发明专利技术公开了一种非糖基化人促红细胞生成素的高效重组表达与纯化方法，本发明专利技术方法将h-ngEPO基因与分子伴侣SUMO序列融合，构建了一种新型的SUMO-rh-ngEPO融合基因表达载体，将该载体转让宿主菌中，从而建立了一种工程菌，通过培养该工程菌并诱导表达SUMO-rh-ngEPO融合蛋白，切除SUMO部分，即可得到rh-ngEPO蛋白。该方法实现了rh-ngEPO蛋白在细胞质内的可溶性表达及大规模纯化，所得rh-ngEPO蛋白活性高。本发明专利技术还提供了非糖基化人促红细胞生成素的聚乙二醇修饰化方法，通过该修饰方法得到的聚乙二醇修饰化非糖基化人促红细胞生成素的半衰期明显延长，且其促红细胞增殖活性也得到显著的提高，可广泛应用于制备促红细胞生成类药物。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于医药生物
，具体涉及非糖基化人促红细胞生成素的高效表达与纯化方法，以及非糖基化人促红细胞生成素的聚乙二醇修饰化的方法。
技术介绍
人促红细胞生成素(hEPO)是人调节红细胞生成的主要调控因子。主要通过促进骨髓中红系祖细胞的存活、增殖和分化，抑制凋亡以调控红细胞的生成。临床上主要用于增加红血球的数目，用于慢性肾功能衰竭导致的贫血、艾滋病患者贫血、再生障碍性贫血、类风湿关节炎患者贫血、骨髓增生异常综合症患者贫血、镰刀型红细胞性贫血、恶性肿瘤或化疗导致的贫血、失血后贫血、组织断离、早产儿等多个方面。在基因重组技术诞生之前，EPO主要从贫血患者的尿和绵羊血中提取，得率非常低，且极不稳定(ΕΡ0单体半衰期仅I个多小时)，理化和生物性质难以测定，无法大规模应用。利用基因工程技术手段生产的重组人红细胞生成素，可克服这一弊端。rhEPO已经在真核表达系统中国仓鼠卵巢细胞CHO系统中获得表达，但生产成本高、产量低。在大肠杆菌中表达的促红细胞生成素为非糖基化蛋白(rh-ngEPO)，常形成不可溶、无生物活性的包涵体， 即使复性在体内也没有活性。此外，缺乏特异性纯化方法，也限制了 rhEPO的规模化制备。SUMO (small ubi quit in-re lated modifier,小泛素相关修饰因子)融合蛋白表达系统是近年发展的一种新型蛋白表达系统，与其它蛋白表达系统相比，具有以下几点优势: DSUMO不仅可以提高蛋白质在宿主菌中的表达量，而且能够大大增加蛋白的可溶性；2)准确无误地切除融合标签。由于融合标签会影响重组蛋白的结构和功能，所以融合蛋白必须切除融合标签，通常采用化学或酶学方法，如Xa因子、凝血酶等。然而酶切融合蛋白有很多问题，产率低、蛋白沉淀、酶切条件复杂、蛋白酶昂贵等，此外还经常产生非预期的N-端。和其他蛋白酶不同，SUMO酶识别SUMO标签的三级结构，因而能准确地切除，不会产生延伸的 N-端，而且酶切条件(pH、温度和离子强度)很宽松。但SUMO表达系统是否能用于EPO的表达尚未见报道。聚乙二醇(PEG)修饰，或称PEG化(PEGylation)，是二十世纪70年代后期逐渐发展起来的一项热门技术，是目前对蛋白质进行化学修饰最重要的技术之一，是用来解决或缓解蛋白和多肽在药用过程中存在的诸多问题的有效途径。用PEG修饰蛋白质和多肽药物可大大增加蛋白质和多肽药物的抗蛋白水解酶的降解作用。对蛋白质类药物，由于PEG修饰后，其在体内的循环半衰期显著增长，PEG修饰后，蛋白质药物在体内的药效是增大的。但是，与PEG偶合后的蛋白质和多肽，其空间构象，空间位阻，静电结合性，疏水性等理化性质都会发生变化，与受体连接的亲和力经常因这些理化性质的变化而降低，从而导致聚乙二醇修饰后蛋白质和多肽药物的体外药效降低。由此可见，蛋白质药物在生物体内易被蛋白酶降解，而经过PEG修饰化的蛋白质药物可以延长其半衰期，但其体外药效一般会降低。因此，如何延长rhEPO蛋白在血浆中的半衰期，同时提高rhEPO蛋白的药物活性，需要系统的研究。
技术实现思路
本专利技术的一个目的在于提供一种人促红细胞生成素的生产方法。本专利技术的另一个目的是提供一种聚乙二醇修饰化人促红细胞生成素的制备方法。本专利技术所采用的技术方案是I、一种融合基因，其编码SUM0-rh-ngEP0融合蛋白。优选的，所述的融合基因具有SEQ ID NO. I所示的核苷酸序列。2、含有上述融合基因的表达载体。3、重组非糖基化人促红细胞生成素(ngEPO)的生产方法，包括如下步骤1)将权利要求3所述的表达载体转入宿主菌中，诱导表达SUM0-rh-ngEP0融合蛋白；2)分离纯化SUM0-rh-ngEP0蛋白，切除SUMO部分,纯化rh-ngEPO蛋白。4、由3的方法所得到的重组rh-ngEPO蛋白。5、一种聚乙二醇修饰化非糖基化人促红细胞生成素的制备方法，包括如下步骤1)将4所述的rh-ngEPO蛋白与单甲氧基聚乙二醇丙醛(mPEG-ALD)在3 5V反应20 28 小时，加甘氨酸终止反应；2)分离纯化得到聚乙二醇修饰的人促红细胞生成素(PEG-rh-ngEP0)。优选的,步骤I)是在pH 6.0,50 mmol/ L的磷酸盐缓冲液中进行,所述rh-ngEPO 蛋白的浓度为4. 5^5. 5mg/mL。优选的，所述rh-ngEPO蛋白与单甲氧基聚乙二醇丙醛的摩尔比为扩11 :1。优选的，所述单甲氧基聚乙二醇丙醛为20kDa单甲氧基聚乙二醇丙醛 (mPEG-ALD-20kDa)。以上所述的聚乙二醇修饰化非糖基化人促红细胞生成素在制备促红细胞生成类药物中的应用。本专利技术的有益效果在于I)本专利技术将rh-ngEPO基因与小分子泛素样修饰蛋白(SUMO)基因进行融合表达，并对诱导表达条件进行了优化，实现rh-ngEPO蛋白在细胞质内的可溶性高表达，所得目的蛋白占可溶性总蛋白的27. 8 ±4. 36wt%。2)本专利技术设计合成的SUM0-rh-ngEP0融合蛋白带有His标签,经镍离子亲和层析和SUMO蛋白酶解去除SUMO蛋白和His标签后，可以实现rh-ngEPO蛋白的大规模纯化，所得的rh-ngEPO蛋白活性高。3)本专利技术将人促红细胞生成素进行聚乙二醇修饰化，采用单甲氧基聚乙二醇丙醛 (mPEG-ALD)修饰剂，修饰条件温和，交联时未引进其它活性基团，对蛋白质活性影响较小， 同时便于产物的纯化和鉴定。通过该修饰方法所得到的聚乙二醇修饰化人促红细胞生成素的半衰期明显延长，且其促红细胞增殖活性也得到显著的提高。附图说明图I是rh-ngEPO PCR产物电泳图2是SUM0-rh-ngEP0 PCR产物电泳图；图3是质粒pET_3c ( + )电泳图4是pET-SUMO-rh-ngEPO重组质粒图谱；图5是重组PET- SUM0-rh-ngEP0鉴定电泳图(第一泳道是重组PET- SUMO-rh-ngEPO 的Nde I、BamH I双酶切鉴定；第二泳道是菌落PCR鉴定)；图6是SUM0-rh-ngEP0的可溶性表达分析图(M marker ；1 :未诱导的菌体总蛋白；2 诱导后的菌体总蛋白；3 :诱导后的菌体总蛋白上清；4 :诱导后的菌体总蛋白沉淀)；图7是O. 5mM/ ImM IPTG不同温度诱导4h后，SUM0-rh-ngEP0蛋白表达情况分析图； 图8是O. 5mM/ ImM IPTG不同温度诱导24h后，SUM0-rh_ngEP0蛋白表达情况分析图； 图9是SDS-PAGE电泳分析纯化的SUMO-rh-ngEPO (I是菌体总蛋白；2是纯化后的 SUM0-rh-ngEP0 蛋白)；图10是纯化目的蛋白rh-ngEPO的电泳图(M是maker ；1是纯化后的SUMO-rh-ngEPO 蛋白；2是SUMO酶切后的SUMO-rh-ngEPO蛋白；3是纯化后的SUMO-rh-ngEPO蛋白；4是纯化后的目的蛋白rh-ngEPO)；图11是rh-ngEPO蛋白的反相高效液相色谱(RP-HPLC)检测图12是rh-ngEPO或PEG-rh-ngEPO蛋白在37°C的稳定性检测图13是rh-ngEPO或PEG-rh_ngEP0蛋白体外活性检测图14是rh-ngEPO或PEG-rh_n本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：王一飞，赵振岭，利奕成，任哲，
申请(专利权)人：广州暨南生物医药研究开发基地有限公司，
类型：发明
国别省市：
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