一种呼吸道合胞病毒的检测方法技术

本发明专利技术公开了一种呼吸道合胞病毒的检测方法，用子宫内膜腺癌细胞系JEC做呼吸道合胞病毒分离工具，再用间接免疫荧光法检测病毒。本发明专利技术的检测方法可以直观的判断收集标本是否有RSV，方法简单，重复性好，灵敏度高，成本低。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及。
技术介绍
呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus, RSV)属于副粘病毒科肺炎病毒属，是引起冬春季婴幼儿下呼吸道感染最常见、最重要的病原体之一。该病毒的传染性强， 易引起疾病的暴发流行和严重的院内感染。近来也认为RSV是引起老年人严重呼吸系统感染的重要原因，在养老院中的爆发常常引起肺炎，有证据显示RSV感染也与哮喘有一定联系。hlsey等报道RSV感染成人会加重慢性阻塞性肺病；Elden等报道RSV感染在免疫抑制或缺陷、骨髓移植以及血液系统恶性疾病的病人中死亡率较高。RSV可以用多种细胞株 (Hela,Hep-2细胞等)分离培养，其中Hela细胞是最常见的分离RSV的标准工具，以Hela、 Hep-2等细胞为工具分离RSV，该方法特异性较强，但其费时长，一般需广2周才能观察到病变，且成本较高，病毒分离阳性率低；电镜检测法虽是直接检测病毒颗粒，但检出阳性率不高、时间较长，不适合临床快速检测；双抗体夹心ELISA法检测抗原，虽操作方便， 但会造成许多阳性样本漏检。病毒核酸检测应用杂交或聚合酶链反应技术，敏感性强，特异性高，能进行微量检测，但实验条件要求严格，成本高，不适合广大基层医院，同时， 不能避免出现假阳性或假阴性。目前医院病毒病的病原学检测是一个薄弱的环节，而感染性疾病诊断的金标准是病原学的诊断。JEC细胞系是吴中明等建立的一株子宫内膜腺癌细胞系，对多种病毒敏感。我们的研究发现RSV对JEC细胞的敏感性较高，低滴度的RSV即引起JEC细胞病变效应，用自制RSV血清抗体检测RSV，可在JEC细胞胞浆内发现明显的绿色荧光颗粒。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题解决目前RSV检测存在的准确度不高、灵敏度不高或成本高的问题，本专利技术用人子宫内膜腺癌细胞系(JEC)作为工具，分离RSV病毒，用间接免疫荧光法快速、灵敏的检测RSV，与传统方法相比提高了检测的准确度、灵敏度，并降低了检测成本。本专利技术的，用子宫内膜腺癌细胞系JEC做呼吸道合胞病毒分离工具，再用间接免疫荧光法检测病毒。本专利技术所述，包括以下具体步骤(1)培养JEC细胞，JEC细胞复苏后接种于含10%小牛血清的RPMI1640培养液中，置于相对湿度为95 % 98 %，37°C，5 % CO2及37°C条件下培养；每2 3d换液1次，4 5d 传代1次；将生长良好的JEC细胞用0. 25 %胰酶消化后制成细胞悬液，以1 X IO5个/孔的密度接种于96孔培养板，0. 1 ml/孔，置于37°C、5 % CO2培养箱中培养，次日待细胞贴壁后感染病毒；(2)RSV感染JEC，用PBS反复冲洗96孔培养板三次，吸干孔内剩余PBS液，每孔接种40ul咽拭子液放入含双抗的无菌试管内处理池，对照孔接种PBS液40ul，感染1_池后用无血清RPMI1640培养液冲洗96孔培养板三次，吸干孔内剩余液体，每孔加入0. Iml维持液， 含m小牛血清的RPMI1640培养液，每8-1 倒置显微镜下观察一次是否出现细胞病变效应，如果7 未见细胞病变效应再盲传一次；(3)间接免疫荧光法检测RSV，病毒感染7 后，弃去孔内培养液，PBS反复冲洗96 孔培养板三次，然后用冷丙酮固定10分钟，2% Trition-IOO打孔5分钟，PBS液冲洗三次， 3min/次，每孔加入1:2 RSV抗体5ul，湿盒37°C孵育45分钟，PBS液冲洗三次，3min/次， 每孔加入1:30羊抗鼠IgG FITC 二抗10ul，湿盒37°C孵育45分钟，PBS液冲洗三次，3min/ 次，倒置荧光显微镜观察胞内及包膜绿色荧光，如感染组出现明显荧光颗粒，则有RSV的存在。本专利技术达到的有益效果 (1)提高了检测的灵敏度。传统方法是指病毒的分离培养法动物接种(应用少，用于病毒致病性)，鸡胚接种 (用于少数病毒的分离)，组织培养(应用最多)。目前医院病毒病的病原学诊断是一个薄弱环节，而临床检测RSV最主要的方法有传统的细胞培养、抗原检测及RT-PCR法。对RSV敏感的细胞是进行相关研究的重要工具，现国内外常用的敏感细胞有HEp-2，Hela等，人子宫内膜腺癌细胞系(JEC)是吴中明等建立的一株子宫内膜腺癌细胞系，对多种病毒敏感。为了了解RSV对JEC敏感性，本专利技术用RSV感染JEC细胞，观察是否出现细胞病变效应(CPE)，并以Hela细胞作实验对照，对其敏感性进行判断。结果发现，JEC细胞在感染后8-1 开始出现CPE(细胞病变效应)，而Hela在感染后24h才开始出现CPE JEC细胞的TCID50=10_8_125， Hela细胞TCID50=10_5 5，表明JEC细胞对RSV的敏感性大大高于Hela细胞。(2)提高了检测的准确度并降低了检测费用。RT-PCR法假阳性较高，对操作人员的素质和实验环境要求较高，在实验过程中很容易出现污染现象，且核酸探针及检测仪器本身费用昂贵，每份标本费用在100-150元之间；间接免疫荧光法具有简单、快速、敏感性高的优点，每份标本费用在30-50元之间，并且能分离出病毒做病原学的检测。能用新的细胞工具JEC分离RSV，此方法灵敏度高，能检测低滴度的RSV，观察方便容易，提高了检测的灵敏度，更降低了实验成本。具体实施例本专利技术的技术方案为用子宫内膜腺癌细胞系JEC做呼吸道合胞病毒分离工具， 再用间接免疫荧光法检测病毒。JEC细胞复苏后接种于含10%小牛血清的RPMI1640培养液中，置于相对湿度为95 % 98 %，37°C，5 % C02及37°C条件下培养。每2 3d换液1次，4 5d传代1次。将生长良好的JEC细胞用0. 25 %胰酶消化后制成细胞悬液，以IX IO5个/孔的密度接种于96 孔培养板，0. 1 ml/孔，置于37°C、5 % CO2培养箱中培养，次日待细胞贴壁铺满孔底。用PBS 反复冲洗96孔培养板三次，吸干孔内剩余PBS液，每孔接种咽拭子液(上呼吸道感染小孩和成人用药前取咽拭子放入含双抗的无菌试管内处理2- !)40ul，对照孔接种PBS液40ul，感染1- 后用无血清RPMI1640培养液冲洗96孔培养板三次，吸干孔内剩余液体，每孔加入维持液(含H小牛血清的RPMI1640培养液)0. 1ml，每8-1 观察一次是否出现细胞病变效应(CPE)，观察7 后(7 未见CPE者再盲传一次)，弃去孔内培养液，PBS反复冲洗三次， 然后用冷丙酮固定10分钟，2% Trition-IOO打孔5分钟，PBS液冲洗三次(3min/次)，每孔加入1:2 RSV抗体5ul，湿盒37°C孵育45分钟，PBS液冲洗三次(3min/次)，每孔加入1:30 二抗IOul (羊抗鼠IgG FITC)，湿盒37°C孵育45分钟，PBS液冲洗三次(3min/次)，倒置荧光显微镜观察胞内及包膜绿色荧光，感染组出现明显荧光颗粒，表明有感染RSV。权利要求1.，其特征在于用子宫内膜腺癌细胞系JEC做呼吸道合胞病毒分离工具，再用间接免疫荧光法检测病毒。2.根据权利要求1所述，其特征在于包括以下具体步骤(1)培养JEC细胞，JEC细胞复苏后接种于含10%小牛血清的RPMI1640培养液中，置于相对湿度为95 % 98 %，37°C，5 本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：敖弟书，吴中明，
申请(专利权)人：遵义医学院，
类型：发明
国别省市：