一种测定血清中药物活性成分的方法技术

本发明专利技术属药物分析领域，涉及一种测定血清中药物活性成分的方法，尤其涉及测定血清中复方中药的活性成分的方法，本发明专利技术采用高效液相色谱-质谱联用的方法，分析给药后大鼠血清、空白大鼠血清以及药物的提取液，测定该药物中能进入血液发挥药效的活性成分即药物的作用物质基础，并在此基础上确定这些作用物质基础在药物中的含量。本发明专利技术方法能将复方中药作为一个整体进行研究，分析血清中所含的来源于药物的化合物成分群，揭示药物的作用物质基础，并能测定药物活性成分的含量，具有稳定性和重现性好、可操作性强等优点。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属药物分析领域，涉及，尤其涉及测定血清中复方中药的活性成分的方法。
技术介绍
复方中药以其独特的疗效和较小的副作用，在临床上应用已经有数千年的历史。 但是由于其中存在着众多的化学成分，使得对复方中药的作用物质基础以及复方中药的作用机制的研究相当困难。血清药物化学研究显示，中药中虽含有诸多成分，但只有被吸收入血的成分才能产生作用，被认为药物活性成分。传统中药多为口服给药，口服给药后药物成分或经过消化道直接吸收入血，或经肝微粒体酶代谢后入血，其活性成分以血液为介质输送到靶点，从而产生作用。血清中含有的成分被认为是中药在体内直接起作用的物质。自 1992年Homma首次提出血清药物化学的概念以来(Homma M等Analytical Biochemistry 1992 ；202 179-187.)，血清药物化学已经已经在国际上获得广泛认可。麝香保心丸(国药准字Z31020068)主要含麝香、人参提取物、人工牛黄、肉桂、苏合香、蟾酥、冰片。麝香保心丸是芳香温通类治疗胸痹(冠心病、心绞痛)的代表复方中药药物，因其疗效确切、安全方便、价格经济，而成为治疗冠心病、心绞痛的常用药物之一。据统计，麝香保心丸在芳香温通类治疗胸痹的中药中稳居第一，是唯一在全国拥有较高知名度的独家传统中药大品种。所述复方中药的药物活性成分测定已受到本领域研究者的关注。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供，具体涉及一种测定血清中治疗心血管疾病的复方中药的活性成分的方法。本专利技术所涉及的治疗心血管疾病的复方中药是麝香保心丸(国药准字 Z31020068)主要含下述原料药组分麝香、人参提取物、人工牛黄、肉桂、苏合香、蟾酥、冰片，目前该药物的作用物质基础仍然不明确。由于中药成分复杂，导致药物作用物质基础不明确。现有对中药的药效成分研究多偏重于单个成分的药理药效评价，脱离了中医整体协同作用的理论。本专利技术将复方中药作为一个整体进行研究，本专利技术采用高效液相色谱-质谱联用的方法，分析给药后大鼠血清、空白大鼠血清以及药物的提取液，测定该药物中能进入血液发挥药效的活性成分即药物的作用物质基础，并在此基础上确定这些作用物质基础在药物中的含量。本专利技术方法包括如下步骤1.配制药物提取液取500mg药物粉末，用6. 5ml混合溶剂超声提取后12000r/min离心，上清液过 0. 45 μ m滤膜过滤，得到配制的药物提取液；本专利技术在制备药物提取液中，采用的混合溶剂及其比例为甲醇二氯甲烷水= 4:2: 0. 5(V/V)，超声时间为 20min。2.制备空白血清样品羧甲基纤维素钠用纯水制成0. 5%的混悬液，用于SD大鼠灌胃给药(lml/kg大鼠体重)，灌胃0. 5-3小时后，腹腔注射1 %的戊巴比妥钠溶液(0. 15ml/kg大鼠体重)麻醉大鼠，静脉取血，置于涂肝素钠的EP管中，在4°C条件下，3000r/min离心IOmin ；取上清液 400μ 1，加入到5ml EP管中；沉淀蛋白后，涡旋lmin，12000r/min离心10分钟，上清液真空旋转蒸干，残渣加入200 μ 1甲醇复溶，离心；上清液即为空白血清样品；3.制备给药后血清样品所述复方中药药物粉碎成细粉后，用0. 5%的羧甲基纤维素钠制成混悬液，药物的浓度为0. 34g/ml ；SD大鼠给予药物混悬液灌服(3. 4g/kg大鼠体重)。服药0. 5-3小时后， 大鼠腹腔注射的戊巴比妥钠溶液(0. 15ml/kg大鼠体重)麻醉，静脉取血，置涂肝素钠的 EP管中，4°C条件下，3000r/min离心lOmin，取上清液400 μ 1，加入5ml EP管中，沉淀蛋白后，涡旋lmin，12000r/min离心10分钟，上清液真空旋转蒸干，残渣加入200 μ 1甲醇复溶， 离心；上清液即为给药后血清样品；本专利技术在制备空白或给药血清样品中，采用灌胃后2小时从肝门静脉取血，每 400 μ 1血清用甲醇3ml沉淀蛋白；流动相为乙腈0. 5%甲酸水溶液。4.高效液相色谱_质谱联用分析色谱柱Waters Symmetry C18色谱柱，5 μ m，250mm X 4. 6mm ；流动相为甲醇(流动相B)-水(流动相A)系统、乙腈(流动相B)-水系统(流动相A)、乙腈(流动相B) 0.5% 乙酸水溶液(流动相A)或乙腈(流动相B) 0. 5%甲酸水(流动相A)溶液；流速0. SmL/ min ；柱温25°C ；电喷雾离子化源(ESI)，源电压3. 5kv ；干燥气流速lOL/min ；干燥气温度 350°C;喷雾气压力30psi ；MS/MS打碎电压1. 0V，扫描的范围为100_1500u，分别采集正离子和负离子模式下的MS和MS/MS图谱；数据分析采用Chemstation工作站软件。表1为梯度洗脱程序。表本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种测定血清中药物活性成分的方法，其特征是采用高效液相色谱-质谱联用的方法，分析给药后血清、空白血清及药物的提取液，测定药物活性成分及药物活性成分的含量；包括以下步骤(1)配制药物提取液取药物粉末，用混合溶剂超声提取后12000r/min离心，过滤，得药物提取液；(2)制备空白血清样品羧甲基纤维素钠用纯水制成混悬液，动物灌胃给药后，取静脉血，置涂肝素钠的EP管中，离心，沉淀蛋白后，上清液真空旋转蒸干，得空白血清样品；(3)制备给药后血清样品药物碎成细粉后，用0.5%的羧甲基纤维素钠制成混悬液， 药物的浓度为0. 34g/ml, SD大鼠给予药物混悬液灌服3. 4g/kg大鼠体重，服药0. 5-3小时后，大鼠腹腔注射的戊巴比妥钠溶液麻醉，0. 15ml/kg大鼠体重，取静脉血，置涂肝素钠的EP管中，4°C条件下，3000r/min离心IOmin ；取上清液400 μ 1，加入5ml EP管中，沉淀蛋白，涡旋lmin，12000r/min离心10分钟，上清液真空旋转蒸干，残渣加入200 μ 1甲醇复溶， 离心；上清液即给药后血清样品；(4)高效液相色谱_质谱联用分析色谱柱Waters Symmetry C18色谱柱，5 μ m，250mmX 4. 6mm ；流动相为甲醇-水系统、 乙腈_水系统、乙腈-0. 5%乙酸水溶液或乙腈-0. 5%甲酸水溶液；流速0. 8mL/min ；柱温 25°C ；电喷雾离子化源ESI，源电压3. 5kv ；干燥气流速lOL/min ；干燥气温度350°C ；喷雾气压力30psi ；MS/MS打碎电压1. 0V，扫描的范围为100_1500u，分别采集正离子和负离子模式下的MS禾口 MS/MS图谱；(5)比较给药血清和空白血清的质谱图，扣除空白血清中的内源性成分，得给药后血清中的差异性成分，即所测得的药物的活性成分。2.按权利要求1所述的测定血清中药物活性成分的方法，其特征是所述药物为治疗心血管疾病的复方中药。3.按权利要求1所述的测定血清中药物活性成分的方法，其特征是所述药物为麝香保心丸，国药准字...

【专利技术属性】
技术研发人员：张卫东，丁建弥，柳润辉，陈忠樑，姜鹏，徐瑞林，张正光，孙志男，潘芳芳，
申请(专利权)人：上海和黄药业有限公司，
类型：发明
国别省市：