革兰氏阳性细菌全细胞分析方法技术

本申请涉及革兰氏阳性细菌全细胞分析的方法。所述方法能确定样品(例如，临床样品)是否包含一种或多种选定的革兰氏阳性细菌，以及确定例如所述样品中所述选定的革兰氏阳性细菌是否都不具有所选的目的性状、或部分细菌具有所选的目的性状或所有细菌都具有所选的目的性状，或者所述样品中可能存在的其它细菌具有所选的目的性状。在一些实施方案中，所述方法可用于确定所述样品中的抗甲氧苯青霉素(选定的性状)的金黄色葡萄球菌(选定的革兰氏阳性细菌)、凝固酶阴性葡萄球菌(另一种选定的革兰氏阳性细菌)和/或甲氧苯青霉素敏感性金黄色葡萄球菌(MSSA)。例如，可以通过原位杂交(ISH)、荧光原位杂交(FISH)、免疫细胞化学(ICC)或以上两种或更多种的任意组合进行全细胞分析。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本申请涉及全细胞分析领域，并且在一些实施方案中，本申请涉及抗甲氧苯青霉素金黄色葡萄球菌(staphylococcus aureus) (MRSA)和/或抗甲氧苯青霉素的凝固酶阴性葡萄球菌(staphylococci) (MR-CNS)的分析。2.引言通常通过表型方法、基因型方法或基于免疫学的方法鉴定临床样品(例如，鼻或伤口拭样、血液或尿液样品/培养物等)中的细菌。某些类型的细菌，例如抗甲氧苯青霉素的金黄色葡萄球菌(MRSA)，在世界范围的医院快速传播，并且最近在社区内快速传播，并因而对人类健康造成严重威胁。诸如金黄色葡萄球菌(S. aureus)的细菌对甲氧苯青霉素(和所有β -内酰胺抗生素)的抗性主要与编码青霉素结合蛋白^(PBPh，也称为ΡΒΡ2')的 mecA基因的获取相关。PBP2a蛋白参与细菌细胞壁合成(参见Pinho et al.，“An acquired and a native penicillin-binding protein cooperate in building the cell wall of drug-resistant staphylococci (获取的和天然的青霉素结合蛋白协同构建抗药葡萄菌属的细胞壁)，，· PNAS，98(19) :10886-10891 (Sept. 2001))。快速且准确鉴定MRSA在预防和治疗由金黄色葡萄球菌弓丨起的疾病中被认为是重要的。表型分析通常包括在抗生素的存在下培养生物体以及检测细菌生长。为了获得结果，该检测通常需要至少两天(一天用于分离，一天用于敏感度检测)。因为某些表型特征 (例如MRSA药物抗性)需通过复杂的机制来验证，所以培养条件(盐分、温度、接种物大小等)可以显著地影响结果。在一些情况下，这会延误诊断，甚至会导致误诊。基于免疫学的PBP2a蛋白检测方法已有描述(例如Cavassini et al.， "Evaluation of MRSA-Screen,a Simple Anti-PBP 2a Slide Latex Agglutination Kit, for Rapid Detection of Methicillin Resistance in Staphylococcus aureus(MRSA 筛查的评价，一种用于快速检测抗甲氧苯青霉素的金黄色葡萄球菌的简易抗PBP加载玻片 Latex Agglutination 试剂盒)”，J. Clinical Microbiology, 37 (5) 1591-1594 (May, 1999))。该无细胞分析能快速检测细胞裂解物样品中的PBPh蛋白，并进而确认所述样品的至少一些生物体的甲氧苯青霉素抗性。然而，该分析常用于分析培养物中生长的生物体 (这需要一天或两天的生长)，并且不是很敏感(可靠的鉴定需要大约IO7集落形成单位)。最快速且敏感的基因型鉴定方法联合利用细菌的核酸分析和核酸扩增技术。 例如，几种分析利用聚合酶链式反应(PCR)或其它靶标扩增方法(例如，连接酶链式反应)。适用于MRSA检测的PCR分析的一些实例可见于US 5，702，895 (Matsunaga et al.)、6，156，507 (Hiramatsu et al.)和 7，074，599 (UhI et al.)中。这些 PCR 分析是无细胞分析。用于确定MRSA和MSSA的PCR分析还见于Gr5bner et al.，“Evaluation of the BD GeneOhm StaphSR Assay for Detection of Methicillin-Resistant and Methicillin-Susceptible Staphylococcus aureus Isolates from Spiked Positive Blood Culture Bottles (对用于检测来自接种的阳性血培养瓶的抗甲氧苯青霉素抗性和甲氧苯青霉素敏感性金黄色葡萄球菌分离物的BD GeneOhm MaphSR分析的评价)”. J. Clin. Microbiol. ,47(6) :1689-1694(2009)中。无细胞测定分析的一个缺点是丧失了细胞形态，细胞形态在细菌鉴定中通常是有价值的。而且无细胞分析不太可能用于确定(或至少牵涉更复杂的设计来确定)混合的生物群体(参见=Grobneret al. (2009)，第 1691 页第 1 栏，第二段标题“Analysis of blood culture bottles spiked with mixtures of staphylococcal isolates(对接禾中有葡萄球菌分离物混合物的血培养瓶的分析)”下的对分析混合群体的PCR分析缺陷的讨论)。保护形态以及更容易鉴定样品中的混合细菌群体和/或消除由于混合群体而导致的假阳性结果的潜在风险的一个途径是进行全细胞分析，例如原位(细胞内)分析。为了通过全细胞分析确定细菌内的性状(例如甲氧苯青霉素抗性)，通常分析细菌的染色体脱氧核糖核酸(DNA)、mRNA或细胞蛋白。一些性状还与天然的质粒相关。本文公开的专利技术不涉及细胞蛋白分析来确定性状。尽管有很多报道关于真核细胞中mRNA的原位杂交(ISH)分析，但是对细菌中mRNA 或染色体DNA的基于ISH分析的报道似乎并不常见。至少在一定程度上是由于革兰氏阳性细菌的细胞壁的特性，对革兰氏阳性细菌的基于ISH的分析被证实有很多问题(参见例如 Furakawa et al. ，“Comprehensive Analysis of Cell Wall-Permeabilizing Conditions for Highly Sensitive Fluorescence In Situ Hybridization (对高敏感性焚光原位杂交的细胞壁透化条件的综合分析)”，Microbes Environ.，21 (4) :227-234 (2006))。而且，对mRNA和染色体DNA的基于ISH的分析也由于细菌中mRNA的低拷贝数和不稳定性而变得复杂(参见例如 Coleman et al.的弓|言，“mRNA—targeted fluorescent in—situ hybridization(FISH)of Gram-negative bacteria without template amplification or tyramide signal amplification(不用模板扩增或酪胺信号放大的靶向革兰氏阴性细菌 mRNA 的荧光原位杂交(FISH)) ”，J. Microbiological Methods, 71 :246-255 (2007)) 至少有三篇报道关于对革兰氏阳性细菌中mRNA的成功的基于ISH的分析 (参见Hahn et al. , "Detection of mRNA in Streptomyces Cells by Whole-Cell Hybridization with Digoxigenin-Labeled Probes (通过利用地高辛标记的探针的全细胞杂交检测链霉菌细胞中的 mRNA本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：何恩瑞克·斯戴恩德，詹·纯诺夫斯凯，利萨·L·科利马斯，安妮·K·I·拉斯缪森，
申请(专利权)人：阿德万德克斯公司，
类型：发明
国别省市：