本发明专利技术提供了一种人源性电压门控钾通道1.5免疫原性肽段及其用途。所述肽段由人源性电压门控钾通道1.5α亚基跨膜片段S5和S6之间胞外环上连续的13个氨基酸构成，肽段的氨基酸序列为：Glu-Ala-Asp-Asn-Gln-Gly-Thr-His-Phe-Ser-Ser-Ile-Pro，通过免疫学的方法制备针对上述肽段的抗体，可以作为人源性电压门控钾通道1.5以及由其基因编码的超快激活延迟整流钾通道新的、特异性抑制剂，该抗体可用于调节人源性电压门控钾通道1.5以及由其基因编码的超快激活延迟整流钾通道功能的研究。基于上述肽段所制备的单克隆抗体和疫苗将有助于房颤的治疗。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物
，具体涉及一种人源性电压门控钾通道1. 5的胞外环肽段E313的合成和针对该肽段制备的抗体，以及该抗体在作为人源性电压门控钾通道1. 5和由其基因编码的超快激活延迟整流钾通道的特异性抑制剂的应用。
技术介绍
心房颤动，以下简称为房颤，是临床上最常见的心律失常，可以诱发心绞痛和心力衰竭，并可导致血管栓塞等严重并发症的发生，增加死亡率。将房颤心律恢复为窦性心律并长期维持即节律控制是房颤治疗的重要策略。研究表明，心房肌的电重构在房颤的维持和复发中起关键作用且在房颤的早期已经发生，主要特征为心房肌动作电位时程和有效不应期的缩短。临床上常用的房颤转复药物，如胺碘酮等III类抗心律失常药物，因延长心房肌的动作电位时程和有效不应期，可以改善房颤时心房肌的电重构，从而抑制房颤的发作。外向复极钾电流是其作用的主要部位。研究发现，人心房肌细胞上存在一种特有的外向复极钾电流即超快激活延迟整流钾电流，其英文全称为ultrarapid delayed rectifier K+ current，以下简写为Ito，而该电流不存在于人心室肌细胞。Ito在人心房复极中起着极为重要的作用，50%的抑制可引起动作电位时程延长66%。Ito通道的生物物理学和药理学特性与人电压门控性钾通道 1. 5 (human voltage-gated potassium channel 1. 5, hKvl. 5)— ^-JIW^^ffi 性。现已证实，Ito通道主要是由hKvl. 5通道基因编码表达的。hKvl. 5通道基因位于人12 号染色体短臂第1区第3条带，英文简写为12pl3，该通道蛋白是一种重要的电压门控钾离子通道，由四个结构相同的α亚基聚合成，每个α亚基由6个跨膜蛋白分子片段Sl S6 以及N末端和C末端组成，并具有3个胞外环，分别为Ε1、Ε2和Ε3。其中S5，S6主要构成离子通道孔，是钾离子进出细胞的部位。针对Kvl. 5编码序列的反义寡核苷酸在不改变其他电流的情况下，使Ito减小约 50%。一些Kvl. 5通道阻滞剂能延长心房肌的动作电位时程和有效不应期，抑制实验性房颤的发作。这些研究显示，对IKvl.5/IKur的阻滞，能有效延长心房肌的动作电位时程和有效不应期，改善房颤时心房肌的电重构，抑制房颤的发作；但不影响心室的复极电流，因而不导致长QT间期综合征和尖端扭转性室性心动过速的发生。因此，Ikv1. 5/1_成为房颤治疗新的、安全和理想的靶点。然而研究发现，相当多的一部分化合物在阻滞Kvl. 5通道的同时亦能阻滞心脏中的电压门控钠、钙等离子通道。由于电压门控钾通道具有较高的结构同源性，使得不同的电压门控钾通道具有高度一致的药物结合位点。研究发现，Kvl. 5通道与心脏复极HERG和 KCNQ1/KCNE1钾通道阻滞剂结合位点高度保守，因而使得现有的一些Kvl. 5通道阻滞剂，在阻滞Kvl. 5通道的同时，亦对HERG和KCNQ1/KCNE1通道产生阻滞作用，常常会导致药源性的心律失常的发生，阻碍了一些Kvl. 5通道阻滞剂进一步开发成为临床药物。因此，美国食品和药品管理局要求新上市的药物应评估其对心脏复极电流的影响。抗体与抗原的结合具有亲和力高，特异性强的特点，理论上开发出针对hKvl. 5、具有阻滞效应的抗体可以作为hKvl. 5通道特异性的阻滞剂。所有电压门控钾通道的跨膜片段S5和S6所构成的离子通道孔区是钾离子进出细胞的关键部位。针对该部位胞外环肽段的抗体能够对电压门控钾通道产生抑制作用。hKvl. 5/IKur通道是一种功能性表达于人心房肌细胞上的电压门控钾通道，其组成氨基酸序列与其它的电压门控钾通道不同，因此可能制备针对该通道特定肽段的特异性抗体。如同其它针对离子通道孔区胞外环肽段的抗体，针对hKvl. 5/IKur通道跨膜片段S5和S6所构成的离子通道孔区胞外环肽段的抗体，理论上能够对hKvl. 5/IKur通道产生特异性抑制作用，从而开发出一种新型、对房颤具有抑制作用的生物制剂。目前尚未见抗hKvl. 5胞外环肽段E313抗体的相关报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种人源性电压门控钾通道hKvl. 5免疫原性肽段，基于该肽段制备的抗hKvl. 5胞外环肽段E313抗体，可以作为hKvl. 5通道以及由hKvl. 5通道基因编码表达的Ito通道新的、特异性抑制剂。实现本专利技术的具体技术方案(l)hKvl. 5胞外环肽段E313序列的选择hKvl. 5通道跨膜蛋白分子片段S5，S6主要构成离子通道孔，是钾离子进出细胞的部位。根据hKvl. 5通道α亚基跨膜片段S5和S6 之间的胞外环肽段氨基酸的亲水性、表露性和柔韧性等，选择抗原指数高的包含连续13个氨基酸的一段肽段-hKvl. 5胞外环肽段E313，作为抗原决定簇或半抗原。具体氨基酸序列为Glu-Ala-Asp-Asn-Gln-Gly-Thr-His-Phe-Ser-Ser-Ile-ftx)，并应用该肽段作为抗原决定簇/半抗原，制备针对该肽段的抗体。(2)hKvl. 5胞外环肽段E313的合成根据E313肽段氨基酸序列采用多肽自动合成仪，固相法合成hKvl. 5通道胞外环肽段E313。(3)抗hKvl. 5胞外环肽段E313抗体的制备采用戊二醛偶联法，以牛血清白蛋白作为载体蛋白合成多肽-BSA完全抗原。将此抗原与完全或不完全弗氏佐剂一起免疫新西兰大白兔，制备抗hKvl.5胞外环肽段E313抗体。定期测定血清中该抗体的滴度。于免疫 5次后，采血，亲合层析法提纯该抗体。(4)抗hKvl. 5胞外环肽段E313抗体对Ito的抑制作用通过膜片钳技术，观察抗 hKvl. 5胞外环肽段E313抗体对人心房肌细胞上的IKur的抑制作用。(5)抗hKvl. 5胞外环肽段E313抗体对人心房肌细胞动作电位的影响通过膜片钳技术，观察抗hKvl. 5胞外环肽段E313抗体对人心房肌细胞动作电位的影响。(6)抗hKvl. 5胞外环肽段E314抗体特异性鉴定通过免疫印迹法和免疫荧光组织化学法，分别观察抗hKvl. 5胞外环肽段E313 抗体与人心房肌细胞上的hKvl. 5通道蛋白及稳定表达HERG、hKCNQl/hKCNEl通道基因的 HEK293细胞系和人心肌细胞上HERG通道、hKCNQl/hKCNEl通道、电压门控钠通道、L型钙通道蛋白的结合。通过膜片钳技术，观察抗hKvl. 5胞外环肽段E313抗体对上述细胞系和人心房肌细胞电压门控钠通道及L型钙通道电流的影响，明确抗hKvl. 5胞外环肽段E313抗体的特异性。本专利技术具有以下优点(l)hKvl.5通道免疫原性肽段E313可作为抗原决定簇/半抗原制备针对该肽段的抗体，该肽段也可用作检测、筛选和鉴定对hKvl.5/IKur通道蛋白具有抑制功能的抗体所针对的抗原决定簇。(2)基于hKvl. 5通道胞外环肽段E313制备的抗体-抗hKvl. 5胞外环肽段E313 抗体可作为hKvl. 5/IKur通道新的、特异性抑制剂，用于对hKvl. 5/IKur通道功能的研究。该抗体可用于文献报道的以hKvl. 5/IKur为干预靶点的房颤的治疗性研究。基于E313肽段所制备的单克隆抗体和疫苗将有助于房颤的治疗。附图本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：刘坤，杨晓芳，连亦田，戴芝银，杨勇，刘金平，王彦富，王朝晖，王敏，高翔，廖玉华，曾秋棠，刘琳玲，
申请(专利权)人：华中科技大学同济医学院附属协和医院，
类型：发明
国别省市：
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