单细胞核酸分析制造技术

本发明专利技术提供分析小样品或甚至单细胞的基因组DNA和/或RNA的方法。分析基因组DNA的方法可能需要全基因组扩增(WGA)，后续选择的目标核酸的预扩增和扩增。分析RNA的方法可能需要期望的RNA的逆转录，后续选择的目标核酸的预扩增和扩增。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及用于分析小细胞群或单细胞的核酸，如基因组DNA或RNA(如非编码 RNA或mRNA)的方法。
技术介绍
快速及可靠地分析小样品或单细胞的基因组DNA或RNA (如非编码RNA或mRNA) 的障碍是常规聚合酶链式反应(PCR)的重复性已经不适于保证所有感兴趣的目标核酸被充分扩增以被检测。
技术实现思路
在一些实施方式中，本专利技术提供分析单细胞核酸的方法。在特定实施方式中，所述单细胞是哺乳动物细胞，如植入前胚胎的细胞、干细胞、疑似癌细胞、致病生物的细胞和/ 或犯罪现场获得的细胞。在示例的实施方式中，所述细胞是人卵裂球(如来自八细胞期胚胎)或人干细胞。例如，一种用于基因型分析单细胞的示例的方法需要(a)对单细胞的基因组进行全基因组扩增以产生扩增的基因组；(b)预扩增所述扩增的基因组以产生预扩增反应混合物，所述混合物包含一种或多种特异于一种或多种目标核酸(基因座)的扩增子；和(c)扩增并检测所述一种或多种扩增子。在一些实施方式中，实施全基因组扩增(WGA)以使得达不到反应平台期。典型地， WGA进行多于两个扩增循环，并且在特定实施方式中，小于大约10个循环(如，大约4和8 个循环之间，包括4和8个循环)。合适的WGA技术包括引物延伸PCR(PEP)、简并寡核苷酸引物PCR、连接介导 PCR(LMP)、基于T7的DNA线性扩增(TLAD)和多重置换扩增(MDA)。一种分析单细胞RNA的示例的方法需要(a)从单细胞的RNA制备DNA ；(b)预扩增所述DNA以产生预扩增反应混合物，所述混合物包含一种或多种特异于一种或多种目标核酸(目标RNA)的扩增子；和(c)扩增并检测所述一种或多种扩增子。在特定实施方式中，通过逆转录或扩增mRNA制备cDNA。在其它实施方式中，通过逆转录或扩增非编码RNA制备DNA。例如，所述非编码RNA可以是小核仁RNA (snoRNA)、微小 RNA(miRNA)、小干扰 RNA(siRNA)禾Π / 或与 Piwi 蛋白相作用 RNA(piRNA)。可以对从单细胞的基因组DNA或RNA产生的核酸进行预扩增。当从RNA(如通过逆转录)制备DNA时，然后可以在同样的反应混合物中实施预扩增。在一些实施方式中，使用一种或多种特异于一种或多种感兴趣的目标核酸(如基因座)的引物对实现预扩增。在特定实施方式中，预扩增可以进行8-18个循环。在特定实施方式中，扩增混合物中不存在探针。在一些实施方式中，通过预扩增产生的扩增子可以通过进一步扩增而被检测。在特定实施方式中，所述进一步扩增通过使用一种或多种特异于一种或多种感兴趣的目标核酸(基因座)的引物对而实现。这些引物对可以和用于预扩增的那些引物对相同或不同。在示例的实施方式中，可以进行所述预扩增，且得到的预扩增混合物可以在扩增之前分布在微流体装置的分离室中。合适的微流体装置包括(至少部分地包括)由弹性材料制成的那些。在一些实施方式中，通过聚合酶链式反应(PCR)完成所述预扩增和/或扩增。当通过PCR完成所述扩增时，扩增产物的存在可以通过定量实时聚合酶链式反应(qPCR)测定。 在这样的实施方式中，通用的qPCR探针，如双链DNA (dsDNA)染料可以用在扩增混合物中以检测扩增产物。可选地或另外地，可以使用一种或多种目标特异的qPCR探针以检测扩增产物。在示例的实施方式中，使用荧光核酸酶检测测定扩增产物的存在。例如，可以使用双标记的荧光寡核苷酸探针检测扩增产物的存在。在预扩增和/或扩增中使用的引物对可以扩增单核苷酸多态性(SNP)。在特定实施方式中，这些可以与一种或多种遗传缺陷的存在相关联。附图说明图1 达到94个单独细胞的BioMark基因型分析软件SNP基因型分析簇图。图2 来自96个独特SNP TaqMan检测对94个单细胞的BioMark基因型分析软件的全SNP簇图。图3 产生于源自多种总RNA起始水平的特定目标扩增(STA)模板的mi RNA 30C 检测线性“标准曲线”，如在实施例2B中描述的进行分析。用Ct对相对浓度表示数据。EFF 显示了稀释系列的PCR效率。图4 取自同样STA稀释，但来自不同的总RNA起始量的U6检测线性的标准曲线， 如在实施例2B中描述的进行分析。检测证明了来自通过STA的RT步骤和最终在集成流体通路(IFC)中的显著的反应线性。根据Ct值比总RNA数量的ng表示数据。EFF显示了稀释系列的PCR效率。图5 =HiiRNA表达数据的48. 48Ct热度图(实施例2B)。使用不同的总RNA输入量得出数据。STA进行15-18个循环。图6 :miRNA表达数据的96.96Ct热度图。使用不同的总RNA输入量得出数据。STA 进行15-18个循环。具体实施例方式在如评估与体外受精(IVF)相关的样品、CTC和肿瘤一致性研究中，分析核酸(如小样品的基因组DNA)的能力是重要的。单细胞的基因型是多种情况，包括发育生物学、突变检测和细菌学中所感兴趣的。例如，在理解分化、发育、疾病和对多种刺激的细胞应答的分子基础中，编码RNA(mRNA)和非编码RNA的表达模式同样是感兴趣的。在一些实施方式中，本专利技术包括基于全基因组扩增(WGA)的应用的方法，后续选择的目标核酸的预扩增和扩增。WGA的应用在预扩增步骤之前提供了多拷贝基因组，增加了所有感兴趣的目标核酸的完全预扩增的可能性。在其它实施方式中，制备RNA的DNA表现型，例如，从mRNA制备cDNA，后续选择的目标核酸的预扩增和扩增。定义除非另有说明，在本权利要求书和说明书中使用的术语如下述所定义。术语“核酸”指核苷酸多聚体，且除非另有限制，包括已知的天然核苷酸的类似物， 所述类似物能够以与天然存在核苷酸相似的方式发挥作用(如杂交)。所述术语核酸包括任何形式的DNA或RNA，包括例如，基因组DNA ；互补 DNA (cDNA)，其是mRNA的DNA表现型，通常通过信使RNA (mRNA)的逆转录或通过扩增获得； 合成地或通过扩增产生的DNA分子；和mRNA。所述术语核酸包括双链核酸或三链核酸，以及单链分子。在双链核酸或三链核酸中，所述核酸链不需要共延伸(即，双链核酸不需要沿两条链的全部长度双链延伸)。所述术语核酸还包括它们的任何化学修饰，如通过甲基化和/或通过加帽。核酸修饰可以包括添加化学基，所述化学基对个别核酸碱基、磷酸二酯键或整个核酸合并了额外的电荷、极性、氢键、静电交感和特性。这样的修饰可以包括如2’位糖修饰、5位嘧啶修饰、8位嘌呤修饰的碱基修饰，胞嘧啶环外胺修饰，5-溴尿嘧啶的取代，骨架修饰，如异碱基异胞嘧啶和异鸟嘌呤的非常规碱基对组合，等等。更具体地，在一些实施方式中，核酸可以包括多聚脱氧核糖核苷酸(包含2-脱氧-D-核糖)，多聚核糖核苷酸(包含D-核糖)和嘌呤或嘧啶碱基的N-或C-糖苷的任何其它类型核酸，以及其它包含非核苷酸骨架的聚合物，如聚酰胺(如肽核酸(PNA))和聚吗啉(购自Anti-Virals，Inc.，Corvallis, Oregon，及Neugene)聚合物，和其它合成的序列特异的核酸聚合物，假设所述聚合物包含在结构上允许碱基配对和碱基堆积(如在DNA和 RNA中所发现的)的核碱基(nucleobase)。所述术语核酸还包含连接的核酸(LNA本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．一种用于基因型分析单细胞的方法，所述方法包括：（ａ）对单细胞基因组进行全基因组扩增以产生扩增的基因组；（ｂ）预扩增所述扩增的基因组以产生包含一种或多种特异于一种或多种目标核酸的扩增子的预扩增反应混合物；和（ｃ）扩增并检测所述一种或多种扩增子。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：埃米·汉密尔顿，林敏，阿兰·米尔，马丁·皮耶普日克，
申请(专利权)人：弗卢伊蒂格姆公司，
类型：发明
国别省市：US