用于纯化治疗蛋白的水性两相萃取加强的沉淀方法技术

本发明专利技术涉及水性两相萃取（ＡＴＰＥ）加强的沉淀方法，其可用来从粗多组分混合物中回收以及部分纯化包括单克隆抗体的治疗蛋白。所述方法包括形成正向萃取ＰＥＧ－磷酸盐ＡＴＰＥ体系，其中目标产物优先分配到富聚合物相中。第二ＡＴＰＥ反向萃取体系随后通过将来自所述正向萃取的富聚合物相引入富新磷酸盐相中而形成，这引起产物在两相之间的界面处沉淀。随后将该沉淀物回收并再溶解在合适的缓冲液中且可将其传送以便进一步纯化。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及蛋白纯化领域，特别是，涉及从粗多组分混合物中捕获并纯化蛋白的方法。具体地说，本专利技术涉及水性两相萃取体系和蛋白沉淀方法的组合用以实现目标分子的生物分离的用途。
技术介绍
单克隆抗体(mAb)当前代表着由全世界各组织制造或研发的最流行的生物药用产品(参见Jacobi A、Eckermann C和Ambrosius，“生物分离和生物加工(Bios印aration and Bioprocessing) ”，第二版，第2卷，2007, Wiley-VCH, 431页)。该特定治疗市场的高商业需求和由此的价值使得医药公司的着重点放在使其相应mAb制造工艺的生产率达到最大、同时控制相关成本。在过去的十年中，随着哺乳动物细胞培养技术的进展，使典型mAb滴度从十分之几克/升上升到数十克/升，上游技术研发已经朝向解决该挑战有一些迈进(参见 Thommes J、Etzel M.，“色谱分离的供选方案(Alternatives to Chromatographic Separations) Biotechnology Progress 2007;23:42-45)。伴随这些较高产品浓度， 生物反应器技术中的进展意味着公司现在以高达25，000L的体积操作细胞培养工艺(参见Kelley B.，“超大规模单克隆抗体纯化常规单元操作的情形(Very Large Scale Monoclonal Antibody Purification :The Case for Conventional Unit Operation)，，， Biotechnology Progress 2008 ；23 =995-1008) 虽然上游操作已有进展，以满足产品需求增加的挑战，但是已经指出下游加工(DSP)技术的发展没有跟上。市售或研发中的大部分mAb产品的下游纯化目前基于利用涉及使用蛋白A亲和色谱法而构造的加工平台(参见 Shukla AA, Hubbard B, Tressel Τ, Guhan S, Low D.，“单克隆抗体的下游加工-平台方法的应用(Downstream processing of monoclonal antibodies-Application of platform approaches)，，，Journal of Chromatography B 848 :28-39 及 Sommerfeld S 和Mrube J.，“生物技术生产的挑战-单克隆抗体的通用方法和工艺优化(Challenges in biotechnology production-generic processes and process optimisation for monoclonal antibodies)，，，Chemical Engineering and Processing 2005 ；44 1123-1137)。mAb纯化对蛋白A使用的强烈依赖已引起参与mAb产品纯化的工艺工程师中的某些关注。蛋白A色谱法基于需要被捕获的产物的质量来确定规模。可使用10，000L发酵罐来以lg/L的浓度培养表达mAb的细胞系，由此产生总共10kg mAb/批料。如果使用相同的发酵罐来以10g/L的浓度培养表达mAb的细胞系，细胞培养物的体积仍为10，000L，但是其中所含的mAb的质量现在将为100kg。因此，蛋白A色谱柱将需要做成用以捕获IOkg批料的管柱的10倍大(这由于成套设备空间限制而可能是不允许的)，或者作为替代，每批料循环更多次，这将增加工艺时间。因此，色谱法实际上对生物制药用设施的最大生产率强加了限制。就mAb治疗剂的当前市场而言，已经达到这些限制的情况是罕有的(参见Kelley B. “超大规模单克隆抗体纯化常规单元操作的情况(Very Large Scale Monoclonal AntibodyPurification :The Case for Conventional Unit Operation)",Biotechnology Progress 2008 ；23 :995-1008)。然而，面对增加的产品需求，一些工程师已经质疑用于mAb纯化的当前范例的长期可持续性。各公司现在不断增加研发渠道中对mAb候选物的投资。即使这些候选物中仅一部分通过临床试验，这也仍将导致需要多产物设施、非常快速地操作、可挑战生产率限制的密集制造活动。另外，发现mAb产物用于除最初预期的那些应用之外的应用。 这可显著增加对特定mAb的需要，可再次推动成套设备生产率超出其极限。鉴于此，工艺工程师已经开始研究可被称为供选生物分离技术的技术，其具有提供更高加工容量以及可能提供比填充床色谱法更好的规模经济的潜力(参见Przybycien, Τ. M. ；Pujar, N. S. ；Steele, L. Μ. “供选的生物分离操作寿命高于填充床色 iH ^去(Alternative bioseparation operations :life beyond packed-bed chromatography) "Current Opinion in Biotechnology 2004，15 (5)，469—478)。两禾中这类的分离技术为水性两相萃取(ATPE)和沉淀。它们由于比较低的相关操作成本和易于规模化而引起关注。而且因为两者都是基于工艺流体的本体混合，这些技术将用工艺物流的体积、而不是其中所含产物的质量来确定规模，而填充床色谱法基于其中所含产物的质量来确定规模。例如，10，000L细胞培养物将需要10，000L沉淀槽，不管细胞培养物产生的mAb 的浓度是lg/L还是10g/L。沉淀工艺的缺点为可实现的纯化因子比较低。这不仅是由于(down to)非特异性分离机制，还由于杂质截留在沉淀复合物内的潜力，导致在再溶解之前需要彻底洗涤沉淀物以使产物纯度达到最大。工艺稳定性是另一问题，需要筛选宽范围条件来确定每种新抗体产物的最优操作参数。同样，也已经发现了水性两相萃取(ATPE)具有一些缺点。已经进行了数次研究，其中针对单克隆抗体的纯化来优化水性两相萃取方法(参见Andrews ΒΑ, Nielsen S, Asenjo JA. “单克隆抗体在水性两相体系中的分配和纯化(Partitioning and purification of monoclonal antibodies in aqueous two-phase systems)”，Bioseparation 1996 ；6 303-313 禾口 Azevedo AM, Rosa PAJ, Ferreira IF, Aires-Barros MR. “人类抗体的水性两相萃取的优化(Optimisation of aqueous two-phase extraction of human antibodies)，，， Journal of Biotechnology 2007;132:209-217)。这些研究显示出比较有前途的结果，获得了高抗体产率，然而，由于ATPE方法所使用的非特异性分离机制而仅得到中度的纯化因子。认为与ATPE相关的关键工艺参数全部影响工艺本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．从多组分混合物中回收并纯化蛋白的方法，所述方法包括：ａ．向所述多组分混合物中加入包括聚合物、含不相容阴离子的盐和分配调节盐的相形成组分；ｂ．混合并完全溶解上述相形成组分以形成正向萃取水性两相体系；ｃ．回收富聚合物相；ｄ．使所述富聚合物相与反向萃取缓冲液接触以形成包括含所述蛋白的界面沉淀物的反向萃取水性两相体系；ｅ．从所述两相体系中回收所述界面沉淀物；和ｆ．任选地使所述沉淀物再悬浮在再悬浮缓冲液中。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：R·特兰，
申请(专利权)人：通用电气健康护理生物科学股份公司，
类型：发明
国别省市：SE