一种用斑马鱼定量评价化合物肝毒性的方法技术

本发明专利技术涉及一种用斑马鱼定量评价化合物肝毒性的方法，主要包括：斑马鱼选取，化合物处理，定性分析和/或定量分析几个步骤。本发明专利技术的方法具有可靠、快速、高效、高性价比等优点，可实现体内高通量评价化合物的肝毒性。本发明专利技术能明显提高化合物肝毒性评价的速度，对加快大规模的化合物肝毒性评价具有重要意义。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及化合物检测和药物毒性与安全性评价领域，具体涉及一种简单、经济、 高通量实现利用斑马鱼幼鱼(larva)定量评价化合物肝毒性的方法。
技术介绍
肝脏是体内最大的实质性器官，成人的肝重量约占体重的3%左右。肝脏具有特殊的解剖位置、组织结构与生理生化特性。在机体内肝脏不仅作为人体物质与能量代谢的重要器官。化学物质无论从何种途径进入机体，最终均通过血液循环系统迅速到达肝脏，尤其从消化道吸收的毒性化合物，在进入体循环以前首先与肝脏接触。肝脏作为毒性化合物生物转化的主要器官，在一定条件下，毒性化合物极易对肝脏造成损害作用，特别是经体内代谢增毒的外源化学物质在肝脏代谢转化后其有毒代谢产物可首先损害肝脏。因此肝脏是毒性化合物的重要靶器官。人类环境中的许多化学物质(包括药物)，在一定剂量水平均可对肝脏造成损害作用。凡是能引起肝脏损害的化学物质均可称为肝毒性化合物。化学毒物引起的肝损伤可以分为急性肝损伤和慢性肝损伤。急性肝损伤一般是短期接触较大剂量肝毒物或者肝脏功能不全时接触某种肝毒物引起病理改变常见肝细胞坏死、脂肪变性、胆汁淤积等。慢性肝损伤可因长期低剂量肝毒物引起，也可由一次急性坏死引起的后遗症，病理改变包括纤维化、 硬变、癌变等。肝毒性是制约化学品开发、生产和应用的重要原因。一项调查显示，84种化合物因为临床毒性而终止进一步药物开发，其中15种(18% )是因为肝毒性。肝毒性也是上市药物因安全问题回收的主要原因。从1961年到1992年，法、德、英和美国共回收181种药物， 其中23种是因为肝毒性(13% ) 。评价化合物肝毒性的方法有两大类，一类是体外试验，另一类是体内试验。肝毒性的体外试验检测方法有以下几种①离体肝脏灌流②肝组织切片③离体肝细胞④肝细胞系 ⑤亚细胞组分⑥遗传工程细胞。体内试验评价采用整体动物试验。最常用的实验动物为大鼠或者小鼠其次为仓鼠、豚鼠、兔、狗等。体内试验的检测方法有以下几类①血清酶学检测②肝脏排泄功能检测③肝脏化学组成成分改变的检测④肝脏组织病理学检查。研究表明以上的一些方法虽然是经典的化合物肝毒性评价方法，但有很多的弊端和局限性。体外实验所需费用较低，但缺少了生物整体的循环转换和药物在体内的循环分布，不能真正反映药物的整体生物活性，体内试验通常化合物用量大、实验周期长，操作复杂，价格昂贵，特异性差，而且不可以进行高通量筛选。因此建立一种能很好的模拟毒性化合物在体内的过程，又能快速方便的筛选肝毒性化合物具有重要意义。斑马鱼是一种新颖的模式生物，越来越广泛的应用于化合物毒性评价实验中。与传统的体内和体外筛选模型相较，活体斑马鱼筛选模型具有诸多优势，克服了原有体外模型在吸收、分布、代谢和排泄环节验证的欠缺及传统体内筛选模型实验周期长、成本高的弊端。与线虫、果蝇相比，斑马鱼是一种脊椎动物，与人类基因高度相似，经英国专家的基因预测发现，斑马鱼的基因与人类基因的相似度高达85%左右，实验结果可比性强。与鼠类等哺乳动物相比，斑马鱼胚胎透明，可同时观察分析多个器官，实验周期短，样本容量大，结果可信度高，所需费用低W]。更重要的是，斑马鱼具有与生俱来的优点W，5] 1)饲养成本低， 性成熟周期短；幻繁殖能力强，一尾雌鱼每次可产200 300枚卵；幻生长发育速度快，在受精24h后，斑马鱼主要的组织器官原基已形成，可为研究提供大量的样本和较短的实验周期；4)胚胎及幼鱼透明，体外受精，体外发育，可直接观察，并可同时分析多个器官系统； 5)胚胎有可以提供营养的卵黄，第一周内不需喂食，可避免化合物处理时化合物与食物成份的相互作用；6)胚胎很小，幼鱼体长只有l_4mm，能够在一个标准的6、12、24、48或96孔板内进行分析；7)给药方式简单溶于水的小分子物质可直接经皮肤、鳃及消化系统进入斑马鱼体内；不溶于水的物质、大分子物质及蛋白质可进行显微注射。因此斑马鱼可作为很好的化合物肝毒性的研究材料。目前利用斑马鱼研究化合物肝毒性的报道较少，并且大多集中在对与肝脏形成相关的因子进行遗传学分析方面W-ll]。McGra I^atricia和Li Chimqi在一篇综述性文章提到可以用斑马鱼评价药物的肝毒性，肝毒性药物处理后的斑马鱼肝脏形状不规则、边缘模糊、肝组织颜色加深变为深棕色或者黑色，但是该文章只是提到用斑马鱼定性评价化合物肝毒性的可能性W]。Mdler等利用突变体斑马鱼建立评价肝肿大、脂肪肝、胆汁淤积等肝脏疾病的模型。Amali等利用硫代乙酰胺处理斑马鱼建立筛选抗脂肪肝药物的斑马鱼模型。Passeri等利用斑马鱼研究乙醇诱发的脂肪变性的分子机制。专利 20101070675. 2公开了一种用模式生物斑马鱼筛选肝损伤药物的方法，但是该方法利用成年斑马鱼进行筛选，实验周期长、所需费用较高、不能进行高通量筛选。
技术实现思路
为了克服上述现有的评价肝毒性化合物方法所存在的缺陷和不足，专利技术人经过研究，旨在提供了一种方便快捷、经济实用的利用斑马鱼定量筛选肝毒性化合物的体内实验分析方法。本专利技术是通过以下技术方案来实现的，其特征在于，包括以下步骤(1)斑马鱼选取选取受精后2-7天的正常发育的斑马鱼，放入微孔板中，(2)化合物处理移除微孔板中的培养液，设置多个实验组待测化合物处理组、阳性对照组、溶剂对照组、空白对照组，每个实验组根据微孔板的规格分别加入相应的溶液，然后恒温培养；(3)定性分析和/或定量分析。优选的，所述的步骤(1)斑马鱼选取受精2天后的斑马鱼；优选的，所述的步骤( 化合物处理中斑马鱼在下恒温培养；优选的，所述的步骤( 化合物处理中斑马鱼培养72小时；优选的，所述的微孔板选用6-384孔微孔板；优选的，所述的步骤O)中阳性对照组中使用的溶液为四氯化碳；优选的，所述的步骤O)中溶剂对照组中使用的溶液为0. 1 %的DMSO ；优选的，所述的步骤O)中空白对照组中使用的溶液为养殖用水；优选的，所述的步骤(3)中定性分析步骤如下A)移除微孔板中养殖用水，加入等体积1 XMESAB (甲磺酸)麻醉斑马鱼，用3%甲基纤维素胶固定后，再置于解剖显微镜下观察斑马鱼肝脏；B)溶剂对照组和空白对照组中可以观察到透明的斑马鱼肝脏；阳性对照组可以观察到深棕色或者黑色不透明的斑马鱼肝脏；观察化合物处理组斑马鱼肝脏，如化合物处理组斑马鱼肝脏表现出深棕色或者黑色不透明，则可判断该化合物具有肝毒性；优选的，所述的步骤(3)中定量分析步骤如下利用图像处理软件进行图像定量分析；选定整个肝脏区域，计算肝脏明亮度总和， 每个浓度组取10只斑马鱼的图片进行分析；肝脏损伤率计算公式为权利要求1.，其特征在于，包括以下步骤(1)斑马鱼选取选取受精后2-7天的正常发育的斑马鱼，放入微孔板中；(2)化合物处理移除微孔板中的培养液，设置多个实验组待测化合物处理组、阳性对照组、溶剂对照组、空白对照组，每个实验组根据微孔板的规格分别加入相应的溶液，然后恒温培养；(3)定性分析和/或定量分析。2.根据权利要求1所述的评价化合物肝毒性的方法，其特征在于马鱼选取受精后2天的斑马鱼。3.根据权利要求1所述的评价化合物肝毒性的方法，其特征在于合物处理中斑马鱼于下恒温培养。4.根据权利要求1所述的评价化合物肝毒性的方法，其特征在于合物处理中斑马鱼培养72小时。5本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．一种用斑马鱼定量评价化合物肝毒性的方法，其特征在于，包括以下步骤：（１）斑马鱼选取选取受精后２－７天的正常发育的斑马鱼，放入微孔板中；（２）化合物处理移除微孔板中的培养液，设置多个实验组：待测化合物处理组、阳性对照组、溶剂对照组、空白对照组，每个实验组根据微孔板的规格分别加入相应的溶液，然后恒温培养；（３）定性分析和／或定量分析。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：陈汝家，李春启，
申请(专利权)人：杭州环特生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：86