本发明专利技术提供一种激活素受体相互作用蛋白2基因在制备药物中的应用，涉及肝脏疾病基因治疗药物领域。应用激活素受体相互作用蛋白2基因作为治疗肝脏疾病的基因治疗药物，其特征是将重组ARIP2基因真核细胞表达载体转染肝细胞，在肝细胞内ARIP2基因表达的ARIP2蛋白可以维持肝细胞生存，降低炎性介质及细胞外基质产生，从而有利于肝实质细胞再生，并抑制肝脏炎症及纤维化形成，可用于急性肝脏疾病及慢性肝脏疾病包括肝纤维化及肝硬化等肝脏疾病的治疗。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及肝脏疾病基因治疗药物领域，发现激活素受体相互作用蛋白 2(activin receptor-interacting protein 2，ARIP2)基因在肝细胞内表达的 ARIP2 蛋白具有保护肝脏免受损伤及抗肝脏纤维化作用，本专利技术应用重组ARIP2基因注射液治疗急性及慢性肝脏疾病、包括肝纤维化及肝硬化。
技术介绍
中国有近1.5亿肝炎病毒感染者，其中肝炎患者超过千万，而各种肝炎最主要的并发症、也是肝炎患者的主要致死原因——就是慢性肝损伤诱导肝纤维化形成、肝纤维化进一步发展导致的不可逆性肝硬化。随着肝细胞损伤及肝纤维化发病机制的深入研究，发现许多细胞因子及信号传导网络参与急慢性肝细胞损伤及肝纤维化的发生、发展过程，如转化生长因子β (TGF-β)、激活素A(ACtivin Α)及肿瘤坏死因子(TNF-α )等。激活素A 是TGF-β超族家成员，近年研究显示其在急性肝损伤及慢性肝损伤、肝纤维形成中发挥重要作用。激活素受体相互作用蛋白2(ARIP2)是近年克隆的、具有抑制激活素信号传导作用的细胞内信号调节蛋白。阻断相应的信号传导途径是慢性损伤所致肝纤维化治疗的有效手段，部分研究采用TGF-β信号传导阻断剂如TGF-β受体抑制剂、内皮素受体及血管紧张素II受体拮抗剂等，均显示具有一定的抗肝纤维化作用。采用高效特异的肝纤维化相关因子阻断剂进行基因治疗已成为最具前景的治疗手段。目前基因治疗研究包括体内导入构建的无活性的 TGF-β II型受体腺病毒载体调控TGF-β的作用，在体外能阻断肝星型细胞(HSC)激活，从而调控细胞外基质(ECM)的合成及降解。上述研究由于只是部分改善肝纤维化、对肝损伤治疗作用不明显，因此仍处于实验阶段，目前还没有进入临床治疗阶段的相关研究。
技术实现思路
本专利技术提供一种激活素受体相互作用蛋白2基因在制备治疗肝脏疾病药物中的应用。编码人和小鼠ARIP2蛋白的基因已在Genbank登录并公开，ΒΜ563433及 ΑΥ157057，基因编码氨基酸序列参见kquence NO. 1及kquence NO. 2。一种激活素受体相互作用蛋白2基因在制备治疗肝脏疾病药物中的应用。本专利技术激活素受体相互作用蛋白2基因的同源基因在制备治疗肝脏疾病药物中的应用。本专利技术构建重组激活素受体相互作用蛋白2基因真核细胞表达质粒及病毒载体在制备治疗肝脏疾病药物中的应用。本专利技术基因药物治疗的肝脏疾病包括肝纤维化及肝硬化。本专利技术采用激活素受体相互作用蛋白2与干扰素配伍使用治疗肝脏疾病。选择Con A诱导的小鼠急性及慢性肝损伤实验动物模型，通过静脉注射重组ARIP2基因真核细胞表达载体，分析其对急性及慢性肝脏损伤以及肝纤维化的防治作用。研究发现ARIP2对Con A诱导的急性和慢性肝损伤及肝纤维化均具有防疗作用。本专利技术的积极效果在于随着肝损伤、肝纤维化机制研究的不断深入，尽管发现许多与肝损伤及肝纤维化相关的因子，但到目前为止，还没有发现有效的肝纤维化治疗靶点。 本专利技术提供了一种全新的肝损伤及肝纤维化治疗方法，通过实验动物模型发现采用ARIP2 基因治疗肝损伤及肝纤维化效果显著，有望发展成临床上肝脏疾病的基因治疗药物。附图说明图1是Con A尾静脉注射诱导的慢性肝损伤模型鼠的肝组织Masson染色纤维沉积情况的40倍照片；图2是Con A尾静脉注射诱导的慢性肝损伤模型鼠的肝组织Masson染色纤维沉积情况的200倍照片；图3是Con A尾静脉注射+ARIP2基因治疗的慢性肝损伤模型鼠的肝组织Masson 染色纤维沉积情况的40倍照片；图4是Con A尾静脉注射+ARIP2基因治疗的慢性肝损伤模型鼠的肝组织Masson 染色纤维沉积情况的200倍照片。具体实施例方式实施例11.质粒构建编码人和小鼠ARIP2蛋白的基因已在Genbank登录并公开，BM563433及 AY157057，基因编码氨基酸序列参见kquence NO. 1及kquence NO. 2。根据编码人ARIP2及其同源基因如小鼠ARIP2的基因序列，RT-PCR扩增ARIP2 目的基因片段，将目的片段定向克隆入pcDNA3、pCIneo以及pCMV4等真核表达载体及重组腺病毒转移质粒及骨架质粒pShuttle-cmv及pAdEasy-Ι等，连接产物转化感受态大肠杆菌DH5 α，挑取阳性菌落扩增，碱裂解法提取质粒。用EcoRI、XhoI进行双酶切鉴定，片断正确的重组表达质粒再进行DNA序列分析，取序列正确的表达质粒用于基因治疗，如 pcDNA3-ARIP2、p(Hneo-ARIP2 以及 pCMV4_ARIP2 等。2.ARIP2基因注射液制备将制备好的ARIP2真核表达质粒与脂质体混合，制备ARIP2基因表达质粒注射液，采用重量体积比1 3的ARIP2真核表达质粒pcDNA3-ARIP2或p(Hneo-ARIP2或 PCMV4-ARIP2与Lipofectamine 2000混合后，溶于生理盐水中即可供静脉注射。实施例2激活素受体相互作用蛋白2与干扰素配伍pcDNA3-ARIP2 5 μ gα-干扰素1万单位实验例1下面通过动物实验证实本专利技术中的ARIP2基因表达与肝损伤及肝纤维化的关系实验动物模型制备l)Con A诱导的小鼠急性肝损伤模型取雄性C57BL/6小鼠(体重20 22g)48只，适应性喂养7天，随机分为2组，分别为Control组M只，Con A组M只，Con A组以15mg Con A/kg体重(lg/L生理盐水溶液)尾静脉注射一次，Control组以等体积生理盐水缓冲液尾静脉注射一次。分别于注射后ld、3d、5d及7d各取6只小鼠摘眼球放血处死小鼠，分离血清用于转氨酶测定。2)Con A诱导的小鼠慢性肝损伤模型取雄性C57BL/6小鼠(体重20 22g)48 只，适应性喂养7天，随机分为2组，分别为Control组M只，Con A组M只，Con A组以 IOmg Con A/kg体重(lg/L生理盐水溶液)尾静脉注射，每周一次，连续五周，Control组以等体积生理盐水缓冲液尾静脉注射每周一次，连续五周。各组分别于末次注射后ld、3d、5d 及7d各取6只小鼠摘眼球放血处死小鼠，用4°C预冷生理盐水心脏灌流，收获肝脏组织，经 40g/L多聚甲醛固定，用于组织病理学检测。分离血清用于转氨酶测定。3)血清转氨酶ALT及AST测定血清转氨酶ALT及AST测定是肝损伤程度的重要指标。实验小鼠眼部取血，静置30分钟后3500r/min离心5分钟，取上清待测，96孔板，每个样品做ALT/AST各3复孔另设空白孔，及5个梯度标准曲线孔。每个样品孔加5 μ 1血清样品和25μ1基质液，空白孔只加5μ1样品。标准孔补齐基质液。充分混勻后37°C水浴反应30分钟。每孔加25μ1 2，4 二硝基苯胼，充分混勻后空白孔再加入25μ1酶基质液， 37°C水浴反应20分钟。每孔加入0. 4mol/L NaOH 250 μ 1终止反应，酶标仪上490nm波长测吸光值(A)。绘制标准曲线，根据标准曲线方程求得样品值(U/L)。检测结果见表1-4，Con A注射后不论是急性还是慢性肝损伤小鼠，其外周血AST 及ALT水平均升高，急性在给药后1天转氨酶升本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种激活素受体相互作用蛋白２基因在制备治疗肝脏疾病药物中的应用。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：柳忠辉，王轶楠，
申请(专利权)人：柳忠辉，
类型：发明
国别省市：82
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