本发明专利技术属于微生物工程与酶工程技术领域，具体涉及了一种高稳定性耐有机溶剂脂肪酶产生菌Burkholderiaambifaria?YCJ01，其耐有机溶剂脂肪酶的基因，以及该耐有机溶剂脂肪酶在有机相中催化拆分手性化合物的应用。该菌株为革兰氏阴性菌株，其保藏登记号为：CCTCCNO：M2011058，其耐有机溶剂脂肪酶产量高，具有较宽的pH适应范围，温度稳定性好，对多种有机溶剂有较好的耐受性，其在手性化合物拆分中具有良好的应用前景。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于微生物工程与酶工程
，具体涉及一种耐有机溶剂脂肪酶产生菌，其耐有机溶剂脂肪酶的基因，以及该耐有机溶剂脂肪酶在有机相中催化拆分手性化合物中的应用。
技术介绍
脂肪酶(lipase，EC 3. 1. 1. 3，甘油三酰酯水解酶)是一类能催化长链脂肪酸甘油酯水解为甘油和长链脂肪酸的酶类，在洗涤、制革、食品、生物化工、造纸、医药、环保等行业被广泛应用。脂肪酶在有机相中可以完成酯化、交换及转酯等反应，并具有区域选择性、立体选择性、较高的稳定性，尤其是它的立体选择催化特性，可以用于化学法难以进行的消旋化合物的拆分、不对称合成等。近年来，国内外学者已经致力于应用脂肪酶在有机体系中实现手性化合物，尤其是药物中间体的立体选择性水解或拆分，如利用微生物脂肪酶可完成酮基布洛芬、反应停、心得安等手性药物的立体选择性水解或拆分。与传统的化学方法相比，酶催化拆分外消旋化合物具有反应条件温和、节省能源、专一性强、副反应少、产品纯度高、反应步骤简单、不需手性源、产品成本低等优点。虽然脂肪酶在有机溶剂中催化具有很多优势，但是酶一般在有机溶剂中不稳定。尤其是亲水性的有机溶剂往往会剥夺酶表面的水分子而使其失活。为了提高酶的稳定性，人们采用了化学修饰、固定化或者蛋白质工程对酶进行改造。然而如果酶天然在有机溶剂中稳定，这样就更利于其在有机相中的应用。因此寻找天然耐有机溶剂的脂肪酶，使其在有机溶剂或含有机溶剂的环境中具有较高的催化活性，已成为脂肪酶研究领域的一个重要方向。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种耐有机溶剂脂肪酶的产生菌、耐有机溶剂脂肪酶、耐有机溶剂脂肪酶基因以及该脂肪酶在有机相中催化手性化合物拆分的应用。为了实现本专利技术的目的，本专利技术首先从油污土壤等样品中筛选获得一株耐有机溶剂脂肪酶产生菌，分类命名为BurWiolderia ambifaria YCJOl，保藏日期为2011年3月6 日，保藏单位全称为中国典型培养物保藏中心，简称CCTCC，保藏地址中国武汉，武汉大学，保藏登记号为CCTCC NO =M 2011058。本专利技术对洋葱伯克霍尔德氏菌^zr姑Weria ambifaria YCJOl的生物学特征进行鉴定，该菌株为革兰氏阴性菌株，菌落呈米白色，圆形，边缘整齐，光滑湿润；显微镜观察菌体为杆菌，0. 8 1. 0X1. 6 3. 2mm，专性好氧，生长的最适温度为30°C !35°C。其生理生化特性表现在不出现反硝化反应、明胶反应结果为阳性，氧化酶阳性，可分解脂肪，可利用D-核糖、D-阿拉伯糖、海藻糖等，不可利用麦芽糖。经BIOLOG全自动细菌鉴定仪鉴定，Sim值为0.576 (24h培养)，结果显示该菌鳳予Burkholderia属；16S rDNA序列分析结果表明，该菌株与数据库中^zr姑Weriaambifaria MC40-6菌的同源性为99%。综合BIOLOG和16S rDNA分析结果，该菌株鉴定为 Burkholderia ambifaria，^^ 为 Burkholderia ambifaria YCJO1。H呢焚Burkholderia ambifaria YCJOl进行了产酶条件优化，优化后产酶量高达126. lU/mL,比优化前40. 2 U/mL提高了 2. 1倍。本专利技术对该菌产生的胞外脂肪酶进行了纯化，经过两步分离纯化，得到电泳纯的耐有机溶剂脂肪酶，命名为脂肪酶YCJ01，纯化后脂肪酶的比活性达到4609. 5 U/mg，表观分子量为33kDa。本专利技术对脂肪酶YCJOl进行了酶学性质的研究，实验证明该脂肪酶对多种有机溶剂都具有良好的耐受性。脂肪酶YCJOl的最适反应PH为7. 5，在PH 5. 0 8. 0的范围具有较高的稳定性。其最佳反应温度为60°C，此酶的最佳人工底物为对硝基苯酚棕榈酸酯 (C16)。本专利技术分离克隆到该菌株所产耐有机溶剂脂肪酶YCJOl的编码基因，它具有SEQ ID NO:所示的核苷酸序列:iatggccagatcgatgcgttccagggtggtggcaggggcagtggcttgcgcgatgagcgtcgcgccgttcgcggggacgaccgcgctgatgacgctcgcgacgacgcgcgcggcgatggcggcaaccgcgccggcggacgactacgcgacgacgcgttatccgatcatcctcgtgcacgggctcaccggcaccgacaagtaCgCgggCgtgctcgagtactggtacggcatccaggaggacctgcagcagcatggcgcgaccgtctacgtcgcgaacctgtcgggattccagagcgacgacgggccgaatgggcgcggtgaacaactgctcgcttacgtcaagacggtgctcgccgcgaccggtgcgaccaaggtgaacctggtcggtcacagccagggcggcctcacgtcgcgctatgtcgcggccgtcgcacccgatctCgtCgCgtCggtgacgacgatcggcacgccgcatcgcggctcagagttcgccgacttcgtgcagagcgtactcgcctacgatccgaccggattgtcgtcgtcggtgatcgcagcgttcgccaatgtgttcggtatcctgacgagcagcagC 3.3. C 3.3. C 3. C CaaccaggacgcgctcgccgcactgaagacgctgacgacttcccaggccgccacgtacaaccagaattacccgagcgcgggcctcggcgcgccgggcagctgccagacgggtgcgccgacggaaaccgtcggtggcaatacgcacctgctgtattcgtgggccggcacggcgatccagccgaccatctccgCgttCggCgtgacgggcgcgacggataccagcacgattccgctgatcgacccggcaaacgcgctggacctgtcgacgcttgcgttgttcggcacgggcacggtgatgatcaatcgcgcctcgggccagaacgacgggctcgtgtcgaagtgcagtgcgctgtacgggaaggtgctgagcacgagctacaagtggaaccatctcgatgagatcaaccagttgctcggtgtgcgcggcgcgaatgcggaagatccggtcgcggtgatccgcacgcatgcgaaccggctgaaaCtCgCgggCgtgtga为此基因的改造并在各种外源基因表达系统中高效表达提供了优良的基因材料。通过PCR法分离克隆了这一耐有机溶剂脂肪酶基因，DNA全序列分析结果表明，该耐有机溶剂脂肪酶基因全长1095个核苷酸，编码364个氨基酸，与Burkholderiei c印aciaS31脂肪酶基因同源性为92.4%，氨基 狻序列同源性为96. 4%c 氨基酸序列示于SEQID NO 2 :MetAla ArgSerMetArgSerArgValValAla GlyAlaValAlaCysAla MetSerVal AlaPro本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种耐有机溶剂脂肪酶产生菌，其特征在于该菌为伯克霍尔德氏菌，命名为Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ａｍｂｉｆａｒｉａ ＹＣＪ０１，保藏日期为２０１１年３月６日，保藏单位全称为中国典型培养物保藏中心，简称ＣＣＴＣＣ，保藏地址为中国．武汉．武汉大学，保藏登记号为ＣＣＴＣＣ ＮＯ：Ｍ ２０１１０５８。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：何冰芳，姚长进，曹艳，柏中中，吴斌，李霜，
申请(专利权)人：南京工业大学，
类型：发明
国别省市：84
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