土壤中根肿病菌的特异性PCR检测方法技术

本发明专利技术公开了一种土壤中根肿病菌的特异性PCR检测方法。依据SEQ?ID?No?10中的1-1028位序列设计如SEQ?ID?No?1、2、3、5所示的引物，组成引物对2、4、5，进行特异性PCR检测。本发明专利技术方法检测快速、方法灵敏、特异性好、适用性广、操作简便，可作为一种土壤、植物组织中芸薹根肿病菌的检测有效技术手段，具有非常高的实用价值。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种土壤中根肿病菌(Plasmodiophora brassicae)的特异性PCR检测方法，特别是涉及一种土壤中芸薹根肿病菌的特异性PCR检测方法。
技术介绍
十字花科植物根肿病是由芸薹根肿菌(Plasmodiophora brassicae)侵染引起的一种世界性土传病害，可以危害青菜、卷心菜、甘蓝、白花菜、西兰花、油菜等许多十字花科植物，造成植株地下部根的畸形肿大以及地上部植株矮小、萎蔫，导致作物的产量严重下降或者绝收。病原菌从腐烂的肿大根组织中释放出大量的游动孢子，进而发展成休眠孢子进入田块，田块一旦受到根肿病菌的污染，将长期带菌，不再适宜栽培十字花科植物。因此，该病严重威胁十字花科作物的生产。十字花科植物根肿病最早发现于18-19世纪的地中海西岸和欧洲南部，现在许多国家都有发生。在我国浙江、广东、广西、湖南、福建、江西、江苏、安徽、四川、云南、新疆、西藏、辽宁、山东、台湾、上海、北京等省、市、自治区均有分布。近年来，我国部分地区大白菜根肿病发生面积急剧增加，在上海，2006年上海郊区某西兰花出口基地根肿病严重发生，导致西兰花因不能结球几乎绝产，只能改种其它非十字花科作物。据报导根肿病菌休眠孢子能在土壤中存活15年以上，带菌土壤中根肿菌的休眠孢子很容易通过农用机械、鞋子、家畜的粪便、带菌植株的移栽和灌溉水等方式传播，这使得作使土壤中根肿病菌休眠孢子的数量突增。由于Plasmodiophora brassicae属专性寄生菌，不能在人工培养基上生长，故不能像其它非专性寄生菌一样通过分离、培养来检测土壤是否带菌。应用感病指示作物可以测定土壤是否带菌，然而这种方法要求土壤带菌量至少在 IO3个孢子/克干土以上，且需8周时间才能观察到植株根部肿大。利用分子手段检测根肿病菌的发展迅速，Faggian等(1999年)就报道检测根肿病菌的专一性PCR引物，然而因土壤中存在大量的抑制物质干扰根肿病菌PCR检测的灵敏度，许多检测方法在检测土壤中根肿病菌时检测的灵敏度不高。因此，亟须一种十分高效、灵敏的检测方法来弥补上述不足。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题在于提供一种土壤中根肿病菌的特异性PCR检测方法，以显著提高现有的土壤中根肿病菌检测方法的灵敏度，弥补现有技术的缺陷。本专利技术通过对上海郊区十字花科蔬菜根肿病菌核糖体DNA ITS序列的测定与分析，与近源种、土壤中常见种及十字花科常见病原菌进行比较，设计了 6对引物，经过特异性检验、多种方法提取土壤DNA的PCR检测并与现有的检测引物比较，建立了一种更为灵敏的PCR检测方法，对于土壤中根肿病的快速监测及田块根肿病危害的风险评估具有非常重要的现实意义和应用价值。 具体来说，本专利技术测定了引起上海地区十字花科青菜根肿病菌的病菌核糖体 DNAITS序列，通过与根肿菌纲不同种、土壤中卵菌纲不同病原菌种及镰刀菌不同种间序列的比较，设计了芸薹根肿病菌PCR检测的特异性正向引物2个0^Fl、PbF2)、反向引物3个 (PbRl、I^R2、in3R3)，组成6对引物对，进行目标青菜根肿病菌、青菜上其它病原菌种类、卵菌纲不同病原菌种类及镰刀菌不同种类PCR扩增反应的特异性检验，并对采用不同方法提取的土壤DNA进行根肿病菌灵敏度检测的PCR扩增反应。其中，本专利技术所设计的6对引物对序列分别如下引物对1正向引物I^bFl5'atcattaacacagtgggcgg 3'(参i昏 SEQ ID No 1)反向引物I^bRl5'cgcgcaaacgaacagaaa 3'(参看SEQ ID No 2)引物对2正向引物I^bFl5'atcattaacacagtgggcgg 3'(参i昏 SEQ ID No 1)反向引物1 ^5'gcagcaaagctcattgtctt 3‘(参-f SEQ ID No 3)引物对3正向引物I^bFl5'atcattaacacagtgggcgg 3'(参i昏 SEQ ID No 1)反向引物1 5'tcgttcaagctatgccgc 3'(参看SEQ ID No 4)引物对4正向引物5'ctagcgctgcatcccatat 3'(参·rSEQ ID No 5)反向引物I^bRl5'cgcgcaaacgaacagaaa 3'(参看SEQ ID No 2)引物对5正向引物5'ctagcgctgcatcccatat 3'(参·rSEQ ID No 5)反向引物1 ^5'gcagcaaagctcattgtctt 3‘(参-f SEQ ID No 3)引物对6正向引物5'ctagcgctgcatcccatat 3'(参·rSEQ ID No 5)反向引物1 5'tcgttcaagctatgccgc 3'(参看SEQ ID No 4)所述的PCR扩增反应体系为20 μ 1，包括模板DNA 1 μ L，引物对(正、反向引物)各2 μ L，dNTP 混合物(2. 5mM/ 每种)2 μ L，PCR 反应缓冲液(10 X) 2 μ L，MgCl2 溶液(25mmol/ L) 2 μ L，Taq 酶(IU/ μ L) 0· 4 μ 1，补充去离子水至 20 μ 1。所述的PCR扩增反应条件为95°C5min 1 个循环；95°C 30sec,54°C 30sec，72°C 45sec，;35 循环；72°C IOmin 1 个循环。将上述PCR扩增产物经Agrose凝胶电泳后分析，结果发现引物对2、4和5的 PCR扩增方法可以分别特异、灵敏地扩增根肿病病组织中芸薹根肿病菌在35;3bp、300bp和 331bp的目标片段。分别以引物对2、引物对5为外圈引物对、以引物对4为内圈引物对组成的两种巢式PCR扩增方法均可以特异性扩增出3种方法提取的根肿病土壤DNA在300bp的目标片段， 其中引物对5/引物对4组成的巢式PCR扩增片段比引物对2/引物对4扩增的片段更为清晰、明亮，而用引物对7为外圈引物对和引物对8为内圈引物组成的巢式PCR仅能特异性扩增1种方法提取的根肿病土壤DNA中芸薹根肿病菌在507bp的目标片段。弓丨物对2、5和7分别作为外圈引物对的PCR扩增均可以检测到相当于1μ g病根中的根肿病菌。用引物对7为外圈引物，引物对4和引物对8分别作为内圈引物进行巢式 PCR反应灵敏度检验，引物对4可以检测Ifg第一轮PCR产物，而引物对8仅可以检测IOng 的第一轮PCR产物。由此说明引物对2作为外圈引物对，引物对4作为内圈引物以及引物对5作为外圈引物对，引物对4作为内圈引物的二种巢式PCR检测土壤中芸薹根肿病菌的方法比现有文献报道的引物对7作为外圈引物、引物对8作为内圈引物的巢式PCR检测方法更为灵敏。其中引物对7、8的序列分別如下引物对 7 正向引物 PbITSl :5' acttgcatcg attacgtccc 3'(參看 SEQ ID No 6)反向引物 PbITS2 :5' ggcattctcg agggtatcaa 3'(參看 SEQ ID No7)引物对 8 正向引物 PbITS6 :5' caacgagtca gcttgaatgc 3'(參看 SEQ ID No8)反向引物 PbITS7 :5' tgtttcggct aggatg本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．一种土壤中根肿病菌的特异性ＰＣＲ检测方法，其特征在于，依据ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ　１０中的１－１０２８位序列设计如ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ　１、２、３、５所示的引物，组成引物对２、４、５进行特异性ＰＣＲ检测。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：戴富明，曾蓉，陆金萍，
申请(专利权)人：上海市农业科学院，
类型：发明
国别省市：31