本发明专利技术公布了一种新型锰矿土壤微生物修复剂及其制备方法，从锰矿污染区生长的植物蓖麻的根际(根周围2mm)土壤中筛选获得一株高抗锰的菌株E1，初步鉴定为青霉菌。该菌株在液态培养基中的耐锰度达33000mg/L。筛选出对锰具有高耐受、吸附能力的菌株后，通过生物发酵技术，研制出新型锰矿土壤青霉菌修复剂，可与美洲商陆联合，吸附调控锰矿区重金属污染。本技术可应用于矿山退化生态系统的生态修复及矿区的绿化等方面。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物领域，特别是，提供了。
技术介绍
重金属含量高、营养贫乏、酸碱度不适宜和持水力弱等因素造成锰尾矿渣堆存地域植被缺乏，水土流失严重，重金属随雨水与扬尘扩散。锰尾矿渣已成为一种锰矿地区重要的污染源。通过筛选和栽培适宜植物，同时采作辅助措施，可在尾矿渣堆存区短时间内使植物定居，从而重建植被。有些植物能吸收固定重金属在其根部，有的植物能通过其根系分泌物及其凋落物的分解物与重金属结合形成难溶化合物，从而阻控重金属移迁扩散。重建的植被可控制土壤侵蚀和水土流失，增加土壤营养，恢复退化生态系统的功能和美化环境。在大面积尾矿渣污染区域重建植被，具有技术可靠、操作简便、成本低、控制污染物有效和对环境友好等多重优势。在尾矿渣堆放区进行植被重建时，选择的植物应具有吸收污染物能力强或根部吸收能力强，生长快，根系发达，耐旱性强和对重金属耐受性强等特征；选择耐土壤贫瘠的植物，通过植物一微生物的联合修复，增加土壤的营养。目前，很多的锰矿的尾矿库的矿渣堆放区上没有植被，我们通过试验研究发现，尾矿渣堆放区中的矿渣的酸碱度是植物在上面生存的重要限制因子，由于矿渣的碱性和有机质的缺乏，导致了植物不能在尾矿区土壤中生长，因此在植物微生物联合修复时，要采用强化调控措施能促进植物在尾矿上生长。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供，该新型锰矿土壤微生物修复剂与植物结合起来，可以使植物美洲商陆在锰尾矿渣上生长良好，从而改良矿山生态环境，控制污染，可广泛用于矿山污染控制的优点。一种新型锰矿土壤微生物修复剂的制备方法，其特征是，步骤如下(1)分离菌株取蓖麻根际土样、水和数粒玻璃珠，加入已灭菌瓶中，置于转速为150 r/ min、温度为27. 5°C的摇床中振荡，取悬浮液做浓度梯度分别为10_2、10_3、10_4、10_5的菌悬液，吸取不同浓度的菌悬液于相应的马丁氏培养基中，用涂布棒涂布均勻二8°C培养箱中倒置培养；经7 培养后，观察培养基中微生物的生长情况。(2)纯化菌株采用平板划线纯化法，选取单菌落接种于Mn2+浓度为5500mg/L的马丁氏固态培养基中，28°C培养箱中倒置培养，反复划线纯化直至获得纯菌株。(3)驯化菌株将上述分离纯化得到菌株依次编号为1#、2#、3#……，分批次接种于锰浓度梯度为 11000mg/L、16500 mg/L、22000 mg/L、27500 mg/L、33000 mg/L 的液态培养基中，置于温度为^°C、转速为150 r/min的摇床中培养，筛选出4#菌为高抗锰的菌株。(4)制作斜面菌种将PDA培养基分装于灭菌的试管中，灭菌后摆斜面，待斜面凝固后，无菌操作接种4#菌种，于27. 5°C温箱中培养，菌苔表面孢子生长丰满，呈灰绿色，并有露珠，即可取出备用。(5)摇瓶培养二级菌种采用淀粉、葡萄糖、花生饼粉、蛋白胨、硫酸铵、硫酸镁、磷酸氢二钾和水配制培养基，用10%氢氧化钠调PH值7. 2-7. 4，用三个锥形瓶分装，高压灭菌， 取出降温到40°C不烫手为止，接4#菌种至摇床上振荡培养，直至菌丝形成，获得菌丝。(6)发酵罐培养采用花生饼粉、蔗糖、硫酸铵、甘薯粉、玉米粉、蛋白胨、碳酸钙配制培养基，将发酵罐消毒灭菌，然后将培养基放入发酵罐，接入菌丝，连续搅拌，保持温度，通气量体积比为 1 0.5，保证发酵罐各阀门严密；培养菌丝至成熟，菌丝体粗壮，菌液黏稠有泡沫。(7)固体吸附、菌粉烘干将稻谷皮、甘薯粉、麸皮、肥土、炉灰和黄豆饼粉进行灭菌，然后采用其中的两种或两种以上的原料配制固体吸附剂，放入采用甲醛和硫磺熏蒸灭菌过的培养室，然后接种菌丝，培养4-5天，35-45 °C烘干，得菌粉。所述步骤(1)中的蓖麻根际土样为根周围2mm的土样；所述步骤(4)中的PDA培养基采用马铃薯200份、蔗糖20份，琼脂20份和水1000份配制而成；所述步骤(5)中的培养基采用淀粉2份、葡萄糖1份、花生饼粉2份、蛋白胨0. 4份、硫酸铵0. 25份、硫酸镁0. 025 份、磷酸氢二钾0. 02份和水1000份配制而成；所述步骤(6)中的培养基采用花生饼粉3份、 蔗糖份、硫酸铵0. 25份、甘薯粉2份、玉米粉1份、蛋白胨0. 1份和碳酸钙0. 5份配制而成。作为优选方案一，所述固体吸附剂采用稻谷皮90份、甘薯粉10份配制而成，此时的接种菌丝的重量为固体吸附剂的100%。作为优选方案二，所述固体吸附剂采用麸皮10份、炉灰30份和肥土 60份配制而成，此时接种菌丝的重量为固体吸附剂的40%。作为优选方案三，所述固体吸附剂采用黄豆饼粉10份、肥土 60份、炉灰20份和麸皮10份配制而成，此时接种菌丝的重量为固体吸附剂的40%。所述稻谷皮、甘薯粉、黄豆饼粉、麸皮经121°C蒸汽灭菌Ih ；所述肥土、炉灰在烘炉上160°C灭菌lh。一种按照所述的新型锰矿土壤微生物修复剂的制备方法制备的新型锰矿土壤微生物修复剂。本专利技术的有益效果本专利技术新型锰矿土壤微生物修复剂是基于锰尾矿渣的酸碱度、有机质和有效营养元素含量为基础产生的，其含有丰富的有机质，可提高保水性，局部中和锰尾矿渣的碱性，可较长时间为植物美洲商陆生长提供所需要的营养元素，提高一些必需元素的利用效率。可以使美洲商陆短时间内在锰矿污染地区大量生长，在第一次人工栽培后，不需再次播种。美洲商陆根部能大量富集锰等元素，锰元素固定效率高，从而可以有效地修复锰矿污染的土壤。下面结合实施例对本专利技术进行进一步详细说明。具体实施例方式实施例1 新型微生物修复剂的制备方法，步骤如下(1)取蓖麻根际土样IOg加到含90ml水和数粒玻璃珠的已灭菌250ml三角瓶中，置于摇床中(设定为150 r/min，温度27. 5°C)振荡20min，取悬浮液做浓度梯度各为10_2、10_3、 10_4、10_5，(吸取悬浮液Iml于含9ml水试管(已灭菌)中，此时菌悬液浓度为ΚΓ1，从该浓度菌悬重复上述步骤，得浓度为10_2的菌悬液，依此类推，得浓度分别为10_3、10_4、10_5的菌悬液)；各自吸取0.1 ml不同浓度的菌悬液于相应的马丁氏培养基中，用涂布棒涂布均勻， 培养箱中倒置培养；经7 培养后，观察平板培养基中微生物的生长情况。(2)采用平板划线纯化法，选取单菌落接种于Mn2+浓度为5500 mg/L的马丁氏固态培养基中，28°C培养箱中倒置培养，反复划线纯化直至获得纯菌株。(3 )将上述分离纯化得到菌株依次编号为1#、2#、3#……，分批次接种于锰浓度梯度为 11000 mg/L、16500 mg/L,22000 mg/L,27500 mg/L,33000 mg/L 的液态培养基中(28°C， 150 r/min钟摇床培养3天)，结果4#菌株能在27500 mg/L培养基中大量生长，而在33000 mg/L培养基中微量生长，其它菌株均不能在27500 mg/L培养基中生长。由此筛选出4#菌种为高抗锰的菌株。(4)采用PDA培养基(马铃薯200 g，蔗糖20 g，琼脂20 g水1000 ml pH自然) 100ml，分装于经烘箱170°C灭菌的试管中，塞上棉塞，上面用两层牛皮纸包扎好，121°C灭菌 20 min0取出后摆斜面，待斜面凝固后，无菌操作接种4#菌种，于27. 5°C温箱中培养4天， 菌苔表面孢子生长本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种新型锰矿土壤微生物修复剂的制备方法，其特征是，步骤如下：（１）分离菌株取蓖麻根际土样、水和数粒玻璃珠，加入已灭菌瓶中，置于转速为１５０ ｒ／ｍｉｎ、温度为２７．５℃的摇床中振荡，取悬浮液做浓度梯度分别为１０－２、１０－３、１０－４、１０－５的菌悬液，吸取不同浓度的菌悬液于相应的马丁氏培养基中，用涂布棒涂布均匀，２８℃培养箱中倒置培养；经７２ｈ培养后，观察培养基中微生物的生长情况；（２）纯化菌株采用平板划线纯化法，选取单菌落接种于Ｍｎ２＋浓度为５５００ｍｇ／Ｌ的马丁氏固态培养基中，２８℃培养箱中倒置培养，反复划线纯化直至获得纯菌株；（３）驯化菌株将上述分离纯化得到菌株依次编号为１＃、２＃、３＃……，分批次接种于锰浓度梯度为１１０００ｍｇ／Ｌ、１６５００ ｍｇ／Ｌ、２２０００ ｍｇ／Ｌ、２７５００ ｍｇ／Ｌ、３３０００ｍｇ／Ｌ的液态培养基中， 置于温度为２８℃、转速为１５０ ｒ／ｍｉｎ的摇床中培养，筛选出４＃菌为高抗锰的菌株；（４）制作斜面菌种将ＰＤＡ培养基分装于灭菌的试管中，灭菌后摆斜面，待斜面凝固后，无菌操作接种４＃菌种，于２７．５℃温箱中培养，菌苔表面孢子生长丰满，呈灰绿色，并有露珠，即可取出备用；（５）摇瓶培养二级菌种采用淀粉、葡萄糖、花生饼粉、蛋白胨、硫酸铵、硫酸镁、磷酸氢二钾和水配制培养基，用１０％氢氧化钠调ｐＨ值７．２－７．４，用三个锥形瓶分装，高压灭菌，取出降温到４０℃不烫手为止，接４＃菌种至摇床上振荡培养，直至菌丝形成，获得菌丝；（６）发酵罐培养 采用花生饼粉、蔗糖、硫酸铵、甘薯粉、玉米粉、蛋白胨、碳酸钙配制培养基，将发酵罐消毒灭菌，然后将培养基放入发酵罐，接入菌丝，连续搅拌，保持温度２８℃，通气量体积比为１∶０．５，保证发酵罐各阀门严密；培养菌丝至成熟，菌丝体粗壮，菌液黏稠有泡沫；（７）固体吸附、菌粉烘干将稻谷皮、甘薯粉、麸皮、肥土、炉灰和黄豆饼粉进行灭菌，然后采用其中的两种或两种以上的原料配制固体吸附剂，放入采用甲醛和硫磺熏蒸灭菌过的培养室，然后接种菌丝，培养４－５天，３５－４５℃烘干，得菌粉，即新型微生物修复剂。...
【技术特征摘要】
1.一种新型锰矿土壤微生物修复剂的制备方法，其特征是，步骤如下(1)分离菌株取蓖麻根际土样、水和数粒玻璃珠，加入已灭菌瓶中，置于转速为150 r/min、温度为 27. 5°C的摇床中振荡，取悬浮液做浓度梯度分别为10-2、10-3、10_4、10-5的菌悬液，吸取不同浓度的菌悬液于相应的马丁氏培养基中，用涂布棒涂布均勻二8°C培养箱中倒置培养；经 72h培养后，观察培养基中微生物的生长情况；(2)纯化菌株采用平板划线纯化法，选取单菌落接种于Mn2+浓度为5500mg/L的马丁氏固态培养基中，28°C培养箱中倒置培养，反复划线纯化直至获得纯菌株；(3)驯化菌株将上述分离纯化得到菌株依次编号为1#、2#、3#……，分批次接种于锰浓度梯度为 11000mg/L、16500 mg/L,22000 mg/L,27500 mg/L、33000mg/L 的液态培养基中，置于温度为^°C、转速为150 r/min的摇床中培养，筛选出4#菌为高抗锰的菌株；(4)制作斜面菌种将PDA培养基分装于灭菌的试管中，灭菌后摆斜面，待斜面凝固后，无菌操作接种4#菌种，于27. 5°C温箱中培养，菌苔表面孢子生长丰满，呈灰绿色，并有露珠，即可取出备用；(5)摇瓶培养二级菌种采用淀粉、葡萄糖、花生饼粉、蛋白胨、硫酸铵、硫酸镁、磷酸氢二钾和水配制培养基，用 10%氢氧化钠调pH值7. 2-7. 4，用三个锥形瓶分装，高压灭菌，取出降温到40°C不烫手为止， 接4#菌种至摇床上振荡培养，直至菌丝形成，获得菌丝；(6)发酵罐培养采用花生饼粉、蔗糖、硫酸铵、甘薯粉、玉米粉、蛋白胨、碳酸钙配制培养基，将发酵罐消毒灭菌，然后将培养基放入发酵罐，接入菌丝，连续搅拌，保持温度，通气量体积比为 1 0.5，保证发酵罐各阀门严密；培养菌丝至成熟，菌丝体粗壮，菌液黏稠有泡沫；(7)固体吸附、菌粉烘干将稻谷皮、甘薯粉、麸皮、肥土、炉灰和黄豆饼粉进行灭菌，然后采用...
【专利技术属性】
技术研发人员：李会东，向言词，冯涛，
申请(专利权)人：湖南科技大学，
类型：发明
国别省市：43
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