聚乙二醇胸腺肽1衍生物的纯化方法技术

技术编号:6861096 阅读:364 留言:0更新日期:2012-04-11 18:40
本发明专利技术涉及聚乙二醇胸腺肽1衍生物的纯化方法。所述方法主要采用离子交换层析方法,通过一步层析有效地得到高活性、高纯度和高回收率的聚乙二醇胸腺肽1衍生物,该方法简单、高效,特别适合于产业化生产。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及多肽的聚乙二醇修饰物纯化领域,具体而言就是简单高效地制备高纯度的聚乙二醇修饰多肽产品。本专利技术涉及相当简单的方法,通过一个步骤纯化处高纯度的聚乙二醇胸腺肽1衍生物的方法,特别适合于该产品在医药工业中的大规模生产工艺。
技术介绍
随着基因工程技术和多肽合成技术的发展,多肽药物在20世纪90年代后期有了长足的发展,在国际医药市场中所占份额不断提高。与其他药品相比,多肽药物具备高效、 低毒和特异性强的显著优势。多肽类药物目前已广泛应用于临床研究或治疗过程中。但是,由于多肽类药物自身的特性,使得这类药物在临床上的使用受到了一些的限制,比如较短的体内半衰期、注射次数频繁、容易受到体内的酶解作用从而被迅速清除出体外、容易产生免疫原和抗原、较低的溶解性。目前解决多肽药物以上临床缺陷最有效的办法之一是聚乙二醇化学修饰技术。胸腺素α 1 (Thymosin- α 1,T α 1)是人体中枢免疫器官胸腺所分泌的一种免疫活性极强的多肽激素,最早发现于1966年,1975年被成功分离得到单体并确定了氨基酸序列与核苷酸序列。目前临床上使用最广泛的胸腺素产品是赛生公司的日达仙(Zadaxin),于 1998在美国上市。但是胸腺肽1本身的药物动力学性质较差,在体内逗留时间较短而被排除,其半衰期仅为2小时。因此导致治疗的不方便和治疗成本升高,同时因为价格昂贵普通病人难以承受,治疗质量下降。聚乙二醇修饰胸腺肽1衍生物可以解决胸腺素α 1药代动力学性质差的问题,目前是国内外研究热点之一。专利 WO 03/037272、ZL200410037523. X、CN 200610079506.1、 ZL 03131498. 8、ZL200510117752. 7均公开了聚乙二醇修饰胸腺肽1衍生物的方法。相关专利和文献中,对聚乙二醇修饰胸腺肽1衍生物的纯化均使用反相高效液相色谱层析 (rp-HPLC)纯化方法。但是分子量较低的肽与聚乙二醇反应时很难使得聚乙二醇反应完全, 由于聚乙二醇为高分子聚合物,在使用rp-HPLC制备层析时很难将未参与反应的聚乙二醇有效除掉。做为药物的开发,必须得到较高纯度的产品。但是由于聚乙二醇残留,很难得到高纯度的产品,且质量难以控制。另外,为了达到较好的分离效果,rp-HPLC制备层析一般使用价格昂贵色谱纯乙腈,在产业化生产中成本太高。
技术实现思路
为了克服现有技术的不足之处,对本专利技术的目的在于一种简单高效的。同时,该方法还易于放大及产业化生产工艺。本专利技术的目的在于提供一种用阴离子交换层析纯化聚乙二醇胸腺肽1衍生物的方法,其特征在于一步纯化,纯度高,游离聚乙二醇含量低,回收率高。其中,优选地,所述的聚乙二醇胸腺肽1衍生物具有以下结构特征A-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-B-Asp-Leu-C-Glu -D-E-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn-X-Y-Z,其中,A 选自 H 或 Ac ;B, C,D,E 选自 Lys 或 Arg ;X 选自(Gly) n,(Gly-Ser) η, (Gly-Gly-Ser) η, (Ser-Gly-Gly) η, η = 1-10 ;Y 是 Cys、 高Cys、Lys、Arg或His,并且Y聚乙二醇修饰的残基;Z是OH或NH2 ;优选A为Ac ;B, C, D, E 是 Lys ;X = Gly-Gly ;Y 为 PEG40K 修饰的 Cys ;所述的阴离子交换层析指弱阴离子交换介质和强阴离子交换介质。所述的阴离子交换层析介质聚合物包括S印hadex、Sepharose, Cellulose、 Source、Toyopearl 及 Proteomix ;所述的阴离子交换层析条件为(1)平衡缓冲液离子强度为5 50mmol/L,酸碱度为4. O 9. O ;(2)洗脱缓冲液离子强度为5 200mmol/L,酸碱度为3. O 9. O ;(3)洗脱缓冲液盐离子梯度为O lOOOmmol/L氯化钠。其中缓冲液为乙酸/乙酸钠、磷酸钠盐、碳酸钠盐、柠檬酸钠盐或/和甘氨酸的缓冲液体系;缓冲液中含有O 40%水溶性有机溶剂,该水溶性有机溶剂选自乙腈、甲醇、乙醇或/和异丙醇,优选乙腈,优选地乙腈在缓冲液中的比例为5 20%,更优选10% ;洗脱条件为PH梯度或/和氯化钠梯度,优选氯化钠梯度;缓冲液酸碱度为5.6。本专利技术所公开的,是在研究国内外较为成熟的多肽及蛋白的PEG修饰物的一些纯化方法的基础上,通过试验研究聚乙二醇胸腺肽1衍生物的一些特性及其与阴离子层析介质的一些特殊作用关系,总结并专利技术该方法。本专利技术所述胸腺肽1衍生物的制备方法可使用本领域公知的任何方法进行制备, 此制备方法优选为固相和液相化学合成法。固相方法包括使用Fmoc或Boc保护的氨基酸, 用多肽合成仪自动合成或手工依次合成法进行氨基酸序列的合成,再经切割,经高效液相 (HPLC)分离纯化,冻干所得肽为进行聚乙二醇修饰的中间体前体。本专利技术所述的PEG修饰方法,是通过共价反应使活性PEG (40kD)与胸腺肽 1衍生物中C末端Cys残基的巯基连接。其中活性PEG(40kD)优选分支型聚乙二醇 mPEG2-MAL(40kD)。胸腺肽1衍生物经PEG修饰后,所得样品中主要含有一下几种物质(1)聚乙二醇胸腺肽1衍生物;(2)未被修饰的胸腺肽1衍生物;( 胸腺肽1衍生物二聚体;(4)未参与反应的PEG。使用阴离子交换层析进行纯化,如Q Sepharose F. F。层析上样和平衡缓冲液PH为5. 6,反应产物能很好的结合在层析介质上,未参与反应的PEG直接透过。充分平衡后,使用含IM氯化钠的缓冲液(pH5.6)设置线性梯度洗脱,随着离子强度随梯度洗脱逐渐增大,聚乙二醇胸腺肽1衍生物首先被洗脱出来,随后未被修饰的胸腺肽1衍生物和胸腺肽 1衍生物二聚体才被洗脱下来,其中所得的聚乙二醇胸腺肽1衍生物纯度大于98%,回收率大于60%。经蒸发光散射检测器检测均不含游离PEG。附图说明附图1 :mPEG-MAL(40kD)修饰胸腺肽1衍生物反应液HPLC分析图谱,其中a 聚乙二醇胸腺肽1衍生物;b 未被修饰的胸腺肽1衍生物;C 胸腺肽1衍生物二聚体;d 未参与反应的PEG附图2 =Q Sepharose F. F纯化mPEG-MAL(40kD)修饰胸腺肽1衍生物的示意图附图3 纯化后聚乙二醇胸腺肽1衍生物HPLC-UV分析图谱附图4 纯化后聚乙二醇胸腺肽1衍生物HPLC-ELSD分析图谱具体实施例方式下面的实施是对本专利技术的进一步阐述,而不是对专利技术的限制。实施例1 胸腺肽1衍生物的聚乙二醇修饰步骤1 固相化学合成法制备供聚乙二醇修饰的前体一C端半胱氨酸胸腺肽1衍生物,结构如下Ac-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Ly s-Glu-Lys-LyS-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn-Gly-Gly-Cys-OH(1)所用氨基酸衍生物如下Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Lys (Boc)_0H、Fmoc-Asn(Trt本文档来自技高网
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【技术保护点】
1.一种用阴离子交换层析纯化聚乙二醇胸腺肽1衍生物的方法,其特征在于一步纯化,纯度高,游离聚乙二醇含量低,回收率高。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员:王亚里吕爱锋孙长安王瑞军李蕴波
申请(专利权)人:江苏豪森药业股份有限公司江苏豪森医药研究院有限公司
类型:发明
国别省市:32

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