本发明专利技术提供设计用于特异性化学缀合的人粒细胞集落形成刺激因子(G-CSF)的突变体及其化学缀合物，其作为佐剂在癌症治疗中使用。本发明专利技术提供G-CSF的突变体，其中G-CSF位置133处的苏氨酸(Thr)残基被半胱氨酸(Cys)残基取代，其中所述G-CSF包括SEQ?ID?NO：1中所确定的氨基酸序列。另外，本发明专利技术提供G-CSF的突变体，其中半胱氨酸(Cys)残基被插入到G-CSF的位置135处的甘氨酸(Gly)残基和位置136处的丙氨酸(Ala)残基之间。进一步，本发明专利技术提供化学缀合的突变G-CSF，在其半胱氨酸残基处连接了生物适合聚合物，如聚乙二醇(PEG)，所述半胱氨酸残基是通过取代或插入突变引入的，其由于与生物适合聚合物的缀合，在不降低体内生物活性的同时增加其体内停留时间，从而最终提高其体内生物活性。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及癌症治疗中作为佐剂的人粒细胞集落形成刺激因子(G- CSF)的突变体及其化学缀合物，其用于通过当施用抗癌症药物时刺激从骨髓细胞形成嗜中性粒细胞集落和诱导骨髓细胞向最终阶段分化来抑制白细胞减少，本专利技术更具体地，涉及通过G-CSF 上的特异性位点处的氨基酸取代或插入而修饰的人粒细胞集落形成刺激因子(G-CSF)的突变体，以及其与非蛋白质聚合物，如聚乙二醇(PEG)的化学缀合物。
技术介绍
人造血活动主要在骨髓中进行，并通过多种复杂的途径产生多种血细胞。造血活动由特异性糖蛋白控制，通常称所述糖蛋白为集落形成刺激因子(CSFs)。已经按照它们的活性确定并识别了 CSFs。就是说，在半固体培养基中培养血细胞时，作为生长因子的CSFs 刺激单核细胞、粒细胞或其它造血细胞的克隆形成。例如，粒细胞-CSF(G-CSF)和巨噬细胞-CSF(M-CSF)分别刺激嗜中性粒细胞和巨噬细胞集落的体外形成，而多-CSF，也称为白介素-3 (IL-3)，刺激多种类型的血液和组织细胞，如粒细胞、巨噬细胞、巨核细胞、红细胞， 等的克隆增殖。特别地，已知G-CSF通过刺激嗜中性先祖细胞的分化和/或增殖和激活成熟嗜中性粒细胞来促进嗜中性粒细胞的吞噬活性，并且促进趋化因子的反应性，其中所述 G-CSF是指导髓间干细胞和骨髓外白细胞的分裂和分化的细胞因子((Metcalf，Blood(血液))67 257(1986) ； (Yan 等，Blood(血液))84(3) :795_799 (1994) ； (Bensinger 等， BloocK 血液))81(11) 3158-3163(1993) ； (Roberts 等，Expt ‘ 1 Hematology)22 1156-1163(1994) ； (Neben 等，Blood (血液))81 (7) 1960-1967 (1993))。通常通过放射疗法和/或化学疗法进行恶性肿瘤的治疗，其不合需要地导致白血胞的急剧减少，且伴随白细胞减少而发生免疫性的减弱，因此当放射疗法和/或化学疗法的治疗方法进行一段延长的时期时，导致明显的缺陷。最初将G-CSFs报告为能够通过激活患者的免疫能力有效治疗癌症的佐剂(Lopez等，J. Immunol.(免疫学杂志)131 (6) 2983-2988,1983 ；Platzer 等，J. Exp. Med. 162 :1788_1801，1985)，并且目前用于有效地治疗多种癌症和难以治疗的白血病。G-CSFs的研究最初开始于发现粒细胞-CSF物质出现在人癌CHU-2细胞系(Nomura 等，EMBO J. 8 (5) =871-876,1986)或人膀胱癌细胞系 5637(ffelte 等，Proc. Narl. Acad. Sci. USA(美国国家科学院会刊)82 1526-1530，1985 ；Strige 等，Blood(血液)69(5) =1508-1523,1987)的培养基中，并且纯化具有粒细胞_集落刺激活性且具有 18-19kDa 的分子量的蛋白质(Nomura 等，EMBO J. 5 (5) :871_876，1986)。G-CSFs的cDNA首次由L. M. Souza等从人膀胱癌细胞系5673分离而来 (Science (科学)，232 :61_65 (1986)(见韩国专利公开号1998-77885)， 并且然后从鳞状癌细胞系和外周血巨噬细胞的cDNA文库进行克隆(S. Nagata等，Nature (自然)，319: 415-417(1986) ；S. Nagata 等，EMBO J. ,5:575-581 (1986) ；Y. Komatsu 等，Jpn. J. Cancer Res.(日本癌症研究综述杂志)，78 1179-1181 (1987))。随着基因重组技术的出现，揭示出G-CSFs是在由大肠杆菌(Escherichia coli) 表达大量G-CSF期间作为不可溶性内含体产生的，并通过重折叠转化为活性G-CSFs。由大肠杆菌产生的重组G-CSF(rG-CSF)包括SEQ ID NO :2确定的蛋白质(175个氨基酸)，即SEQ ID NO 1确定的天然G-CSF (174个氨基酸)和N-末端的甲硫氨酸，并且具有约为19kDa的分子量。另外，天然G-CSF在位置第133处的氨基酸苏氨酸(Thr)中具有0_糖基化位点， 而源自大肠杆菌的r G-CSF不具糖基化位点。然而，已知糖基化位点和/或N-末端甲硫氨酸的存在或缺乏对生物活性几乎无影响(Souza等=Science (科学)232，1986，61)。生物蛋白治疗剂，如G-CSF，具有有利地高选择性和低毒性，但它们体内停留时间短并且不稳定。为了克服这些缺点，开发了一种将生物适合性聚合物与生物蛋白(多肽) 缀合的方法，其中所述生物适合聚合物例如聚乙二醇(PEG)、聚乙烯醇(PVA)或聚乙烯吡咯烷酮，所述生物蛋白(多肽)例如G-CSF或干扰素。此PEG缀合通过有效地抑制蛋白酶而阻止生物蛋白的降解，通过阻止生物蛋白治疗剂从肾脏的快速排泄而增加生物蛋白治疗剂的稳定性和半衰期，并降低其免疫原性(Sada等，J. Fermentation Bioengineering(发酵生物工程杂志)71 137-139 (1991))。特别地，PEG化的蛋白治疗剂的实例包括一种腺苷脱氨酶的PEG化制剂，其被开发为组合的免疫缺陷的治疗剂；一种干扰素的PEG化制剂，其被开发为肝炎的治疗剂；以及葡糖脑苷脂酶和血红蛋白的PEG化制剂，等。除PEG外，乙二醇/丙二醇的共聚物，羧甲基纤维素，葡聚糖，聚乙烯醇，聚乙烯吡咯烷酮，聚-1，3- 二氧戊环，聚-1，3，6-三噁烷，乙烯/马来酐共聚物，聚氨基酸(均聚物或随机共聚物)通常在化学偶联所述蛋白质治疗剂中使用。由于作为具有通式HO- (-CH2CH2O-) n_H的聚合化合物的PEG是高亲水性的，所述它与蛋白质结合，以用于医药应用，从而增加其溶解性。与所述蛋白质结合的PEG具有范围在约1，000_约100,000内的分子量。如果PEG的分子量超过1，000，则PEG具有显著低毒性。 具有约1，000-约6，000范围内分子量的PEG系统性地存在并通过肾脏代谢。特别地，具有分子量约40，000的分支PEG存在于诸如血液、肝等器官中，并通过肾脏代谢。美国专利号4，179，337公开一种具有生理活性的非免疫原性的水溶性多肽组合物，其具有与聚乙二醇(PEG)或聚丙二醇(PPG)偶联的多肽，并具有500-20，000道尔顿的分子量。为了将PEG与多肽偶联，通常使用活化的PEG。通过将PEG的一个末端的羟基转化为甲醚基，另一个末端的羟基转化为亲电子基团来制备活化的PEG，由此使PEG通过该亲电子基团与多肽偶联。然而，由于这样的化学偶联反应是非特异性的，所以对蛋白质，即多肽活性位点的PEG化不合需要地降低该蛋白质的活性，这种情形的实例见于由Roche和 Schering开发的PEG化(PEGylated)的干扰素-α中。由Roche和Schering开发的干扰素-α的PEG缀合物是这样的缀合物，其中PEG分子与干扰素-α分子组合。尽本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．人粒细胞集落形成刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）的突变体，所述突变体包括ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５中包括的氨基酸序列，其中半胱氨酸（Ｃｙｓ）残基被插入到包含于ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１的Ｇ－ＣＳＦ的位置１３５处的甘氨酸（Ｇｌｙ）残基和位置１３６处的丙氨酸（Ａｌａ）残基之间。
【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：康官烨，洪晶云，
申请(专利权)人：牧岩生命工学研究所，
类型：发明
国别省市：KR
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