本发明专利技术公开了一种温度敏感PEI-g-(MeO2MA-b-HEMA)嵌段共聚物及制备方法和应用，
属于温度敏感性转基因载体的制备。该方法过程包括用顺序加料的原子转移自由基聚合技
术，合成聚(2-甲基-2-丙烯酸-2-(2-甲氧基乙氧基)乙酯-b-甲基丙烯酸-β-羟乙酯)
(MeO2MA-b-HEMA)嵌段共聚物。再以羰基二咪唑为反应中间体，先利用羰基二咪唑活化
HEMA链段末端的羟基，然后与聚乙烯亚胺(PEI)偶联反应，制备了
PEI-g-(MeO2MA-b-HEMA)嵌段共聚物。本发明专利技术的优点在于制备方法简单，合成条件温和，
所制得的产物用于转基因载体，可实现对于DNA运输和表达的调控。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及温度敏感性转基因载体的制备，特别是一种聚乙烯亚胺-接枝-聚丙烯酸乙 酯嵌段共聚物及制备方法和应用，具体是聚乙烯亚胺-接枝-聚2-甲基-2-丙烯酸-2-(2-甲氧 基乙氧基)乙酯/甲基丙烯酸-e-羟乙酯[PEI-g-(Me02MA-b-HEMA)]嵌段共聚物及制备方 法和应用。
技术介绍
基因治疗是指将人的正常基因或有治疗作用的基因通过一定方式导入人体靶细胞以 纠正基因的缺陷或者发挥治疗作用。应用于基因治疗的载体主要有病毒载体(viral vector) 和非病毒载体(nonviral vector)两种。可采用的病毒载体有逆转录病毒、腺病毒、腺相关 病毒(AAV)等。非病毒载体包括裸DNA、脂质体、阳离子高聚物等。阳离子高聚物作为非病毒载体的一部分，它既存在非病毒载体的特点(即低毒性，低 免疫原性和低致癌性)以外，还有自身的优势，易制备和携带目的基因能力高，有利于其 作为转基因载体的应用。但基因转染效率远低于病毒载体。常见的阳离子高聚物能够通过 强静电作用有效縮合DNA，形成的聚电解质复合物(PECs)较稳定。这些PECs易于细胞内 化，从内涵体中逃逸，并能保护DNA免受DNA酶的降解。但是，强烈的静电作用也限 制了基因进入细胞核之后从复合物中的释放，限制了基因的表达。针对阳离子聚合物载体 与pDNA复合物解包裹成为最终基因转染的障碍，现在主要是提高其转染的可控制性，进 而提高其转染效率。智能高分子载体的自适应特性能有效解决常规载体对于DNA易包装、难拆解的难 题，具有很好的应用前景。其中温度敏感性载体以其设计方便，调解灵活的特点受到了极 大的关注，被广泛用于药物、基因控制释放领域。对于温度响应性聚合物来说，其低临界溶解温度以下溶于水，高分子链段呈无规线团 状；温度高于LCST时，高分子链段从水中析出，链段呈密实的小球。温度敏感组分与压 縮DNA组分结合既保持温度响应性，又具有复合DNA的功能，因而，通过改变温度， 利用温度敏感组分的相变可实现对DNA结合和解离的调控。近年来， 一些以聚异丙基丙烯酰胺为温度敏感组分的转基因载体被研制成功，并得到 了很好的转染结果。Hinrichs等首次将异丙基丙烯酰胺(NIPAAm)与N,N，-(二甲基胺乙基)甲基丙烯酸酯(DMAEMA)的共聚物作为温度和pH值响应的转基因载体，其中NIPAAm提 供温度响应性，DMAEMA存在氨基，可提供一定的正电荷密度，可与DNA的静电相互作 用形成复合物。增加共聚物中NIPAAm的含量，复合物的细胞毒性明显降低，这说明 NIPAAm对于DMAEMA的细胞毒性有明显的屏蔽效应。他们的结果显示高分子量的共聚 物对卵巢癌细胞的转染效果较好，但未能得出聚合物的LCST和转染之间的相关性 Yokoyama等将疏水单元甲基丙烯酸丁酯(BMA)弓|入到PNIPAAm-co-DMAEMA体系形成 三元共聚物，来调节相变温度。体外转染实验研究发现温度变化不会影响不含NIPAAm的 共聚物，而三元共聚物的变温培养的转染效率比恒温培养的转染效率高，另外还发现在更 高的温度(37'C和45'C)进行复合得到的复合物比在室温条件下得到的复合物的转染效率更 高。刘文广等通过化学合成方法合成两亲性壳聚糖-接枝-异丙基丙烯酰胺/月桂酸乙烯酯 (PNVLCS)共聚物，并考察PNVLCS共聚物的温度敏感性。研究发现温度变化可引起共聚 物载体的相转变，并影响到与DNA的结合程度。PNVLCS成功地将 pTracerTM-CMV/Bsd/lacZ Vector质粒转入C2C12细胞内，温度敏感PNVLCS共聚物载体的 转染效率可由温度控制进一步提高。最近，刘文广等又通过自由基聚合反应和偶联反应制 备了聚异丙基丙烯酰胺凍精氨酸缀合物(PNIPArg)，通过FTIR和13〔 NMR实验证实了偶联 产物。由浊度法测定了缀合物水溶液的LCST为35.2'C。 PNIPArg缀合物与质粒DNA通过静 电作用形成复合物，呈现均一球状形态。以绿猴肾细胞COS-l为宿主细胞，考察了PNIPArg 载体对含有可表达荧光素酶(l uciferase)和绿色荧光蛋白(GFP)的质粒PGL3和pEGFP—C 1 体外转染效率，其转染效率明显高于裸DNA,同脂质体相当。同时可以通过改变温度调控 基因的表达效率，NIPAAm的引入显著降低了载体的细胞毒性。阳离子高聚物的典型代表是聚乙烯亚胺(PEI),它是一种高效的被广泛应用的阳离子高 聚物基因载体。细胞毒性是限制PEI作为非病毒载体进一步应用的主要因素。PEI的转染 效率及细胞毒性与分子量有关。研究发现低分子量(10KDa)和中等支化度的PEI具有高 效转染效率的同时，也具有比商业化高分子量PEI较低的毒性。目前所研究的温度敏感性非病毒载体的温敏组分为聚异丙基丙烯酰胺(PNIPAAm)， PNIPAAm是目前研究和应用最多的一类温度敏感聚合物，其温度敏感行为被认为是这一 领域的黄金法则，然而最近研究者发现PNIPAAm有如下缺点(l)低分子量聚合物的相 转变不可逆性；(2)末端官能团影响聚合物的热行为；(3)体内生物相容性存在问题。最 近，侧链为寡聚乙二醇的温度敏感聚合物越来越引起研究者们的兴趣，有替代PNIPAAm之势。这类温敏聚合物具有更好的生物相容性，相转变几乎不受水溶液浓度、离子强度和 链长等因素影响。该类温敏聚合物有很好的生物应用前景。聚2-甲基-2-丙烯酸-2-(2-甲氧 基乙氧基)乙酯(PMe02MA)是该类聚合物的典型代表，其水溶液的LCST为26°C。本专利技术的目的在于提供一种温度敏感PEI-g-(Me02MA-b-HEMA)嵌段共聚物及制备方 法和应用。该温度敏感PEI-g-(Me02MA-b-HEMA)嵌段共聚物具有转基因的能力并能实现 对于DNA运输和表达的调控。本专利技术制备方法简单，合成条件温和。本专利技术提供的一种温度敏感PEI-g-(Me02MA-b-HEMA)嵌段共聚物的结构如下式所其中，m为50 200, n为10 100， x为25 50，分子量分布指数为1.1 1.3，为 AB型二嵌段共聚物。单体2-甲基-2-丙烯酸-2-(2-甲氧基乙氧基)乙酯与甲基丙烯酸-P-羟乙酯两单体的共聚 比为1-10:1。本专利技术提供的一种温度敏感PEI-g- (Me02MA-b-HEMA)嵌段共聚物的制备方法是经 过以下步骤用顺序加料的原子转移自由基聚合方式，合成聚(2-甲基-2-丙烯酸-2-(2-甲 氧基乙氧基)乙酯-b-甲基丙烯酸-(3-羟乙酯)(Me02MA-b-HEMA)嵌段共聚物；再以羰基二 咪唑为反应中间体，先利用羰基二咪唑活化HEMA链段末端的OH，然后再与聚乙烯亚胺 (PEI)反应，制备PEI-g-(Me02MA-b-HEMA)嵌段共聚物；具体为1) 在Schlenk管中加入单体2-甲基-2-丙烯酸-2-(2-甲氧基乙氧基)乙酯(Me02MA)和催 化剂氯化亚铜，用乙醇溶解，用液氮冷冻，脱气，然后溶解通氮气，反复冻融三次，以除 去反应体系中的氧气；2) 在氮气保护下用注射器将引发剂2-溴异丁酸乙酯(EBiB)和配体2,2'-联吡啶(bpy)的 乙醇溶液加入上述Schlenk管中，反应混合物本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种温度敏感聚乙烯亚胺－接枝－聚丙烯酸寡乙二醇酯嵌段共聚物，其特征在于它的结构为： ＊＊＊ 其中，ｍ为５０～２００，ｎ为１０～１００，ｘ为２５～５０，分子量分布指数为１．１～１．３，为ＡＢ型二嵌段共聚物。
【技术特征摘要】
1、一种温度敏感聚乙烯亚胺-接枝-聚丙烯酸寡乙二醇酯嵌段共聚物，其特征在于它的结构为其中，m为50～200，n为10～100，x为25～50，分子量分布指数为1.1～1.3，为AB型二嵌段共聚物。2、 按照权利要求1所述的嵌段共聚物，其特征在于单体2-甲基-2-丙烯酸-2-(2-甲氧 基乙氧基)乙酯与甲基丙烯酸-(3-羟乙酯两单体的共聚比为1-10:1。3、 一种温度敏感PEI-g-(Me02MA-b-HEMA)嵌段共聚物的制备方法，其特征在于它 是经过以下步骤用顺序加料的原子转移自由基聚合方式，合成聚(2-甲基-2-丙烯酸-2-(2-甲氧基乙氧 基)乙酯-b-甲基丙烯酸-p-羟乙酯)(Me02MA-b-HEMA)嵌段共聚物；再以羰基二咪唑为反 应中间体，先利用羰基二咪唑活化HEMA链段末端的OH，然后再与聚乙烯亚胺(PEI) 反应，制备PEI-g-(Me02MA-b-HEMA)嵌段共聚物；具体为-1 )在Schlenk管中加入单体2-甲基-2-丙烯酸-2-(2-甲氧基乙氧基)乙酯(Me02MA)和催 化剂氯化亚铜，用乙醇溶解，用液氮冷冻，脱气，然后溶解通氮气，反复冻融三次，以除 去反应体系中的氧气；2) 在氮气保护下用注射器将引发剂2-溴异丁酸乙酯(EBiB)和配体2,2'-联吡啶...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘文广，杨建海，张鹏，
申请(专利权)人：刘文广，杨建海，张鹏，
类型：发明
国别省市：12
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