聚乙二醇化重组人干扰素ω偶合物及其制备工艺制造技术

本发明专利技术公开了聚乙二醇化重组人干扰素ω偶联物及其制备工艺，相比未修饰的干扰素ω，在人体内具有更长的半衰期，能够明显减少用药次数，降低毒副作用，特别适合于治疗对干扰素ω敏感的慢性病毒感染，临床上具有广泛的应用前景。

【技术实现步骤摘要】

涉及一种治疗对干扰素w敏感的病毒感染的药物制剂，尤其是一种能够明显减少用药次 数，具有长效作用的聚乙二醇化重组人干扰素偶合物以及其制备工艺。
技术介绍
干扰素是一组具有多种功能的活性蛋白质(主要是糖蛋白)，是一种由单核细胞和淋巴 细胞产生的细胞因子。它们在同种细胞上具有广谱的抗病毒、影响细胞生长和分化、调节免 疫功能等多种生物活性。根据干扰素蛋白质的氨基酸结构、抗原性和细胞来源，可将其分为 :IFN- a 、 IFN- e 、 IFN- y 。 IFN- w属于IFN- a家族，其结构和大小与其它IFN- a稍有差异 ，但抗原性有较大的不同。自80年代以来，许多研究显示，干扰素除具有抗病毒、免疫调节 的作用外，还具有明显的抗细胞增殖作用。干扰素(interferon omega， IFN-)是一类同干扰素a在基因序列上有60%同源性 的新的干扰素分子，具有广谱抗病毒、抗细胞增殖和免疫调节的功能，w干扰素是奥地利科 学家Rudelf Hamptman等于1985年发现的I型干扰素，其与a干扰素功能相近，但抗原性不 同。近年来，研究人员发现人w干扰素具有同a干扰素、y干扰素以及肿瘤坏死因子相似的 ，较强的抗病毒复制、抗细胞增殖等作用，其临床应用已逐渐展开。如美国Biomedicines公 司重组人w干扰素用于治疗丙性肝炎的临床试验已经进入II期临床。蛋白质药物已成为当前药物研究开发的热点，在临床治疗中的地位日益重要。但蛋白 质药物最大的问题是存在自身稳定性差、半衰期短及可能存在的免疫原性等限制。而采用聚 乙二醇修饰蛋白质技术，可有效解决蛋白质药物的此类缺陷。聚乙二醇(polyethleneglycol， PEG)是一种安全无毒、无活性的聚合物，常用于蛋白 药物修饰。Davis, Abuchowski及其同事在20世纪70年代最先研究和开发出聚乙二醇化技术 。研究显示聚乙二醇化能够改变药物动力学，进而可以改变治疗分子的药效学。美国FDA目 前批准了几种聚乙二醇化蛋白质药物，其中包括聚乙二醇化干扰素a 。大量临床研究表明它 无论是单用还是与病毒唑合用治疗慢性丙型肝炎的疗效明显高于未经结构修饰的IFN- a 。临床上，广泛应用的聚乙二醇化干扰素包括先灵葆雅公司的开发的聚乙二醇化干扰素a -2b (商品名，佩乐能，Peglntron);罗氏公司开发的聚乙二醇化干扰素a-2a (商品名， 派罗欣，Pegasys)，通过与利巴韦林联合广泛用于慢性乙型和丙型肝炎的治疗。4本专利技术针对采用蛋白质药物自身存在的缺陷，采用聚乙二醇化技术修饰w-干扰素，提 供了一种聚乙二醇分子与重组人干扰素w的N末端结合，且一个重组人干扰素分子结合一个 聚乙二醇分子的聚乙二醇化重组人干扰素w药物的制备方法。有效提高蛋白质药物自身稳定 性、延长半衰期短以及降低免疫原性，改变药动学，从而改变了药物的药效学，在临床作用 方面具有很好的应用前景。
技术实现思路
本专利技术所要解决的首要技术课题是提供一种有利于工业化生产、且能明显减少用药 次数、用于慢性肝炎临床治疗的聚乙二醇化重组人干扰素药物。本专利技术涉及一种化学修饰的干扰素偶联物，其结构如I式所示 R-L-M-NH-( rhIFN-w) I其中，R表示具有cr4烷烃端基的水溶性聚合物，L表示0、 N、 NH原子， M表示C广6饱和脂肪烃亚基， NH表示rhIFN- w的N末端氨基， rhIFN- w表示基因重组人干扰素w 。其中水溶性聚合物包括聚乙二醇、聚丙二醇、聚乳酸、聚合氨基酸、分支聚乙二醇、分 支聚丙二醇、分支聚合氨基酸等，具有在5kDa 100kDa之间的分子量，优选的水溶性聚合物 为聚乙二醇，具有在5kDa 40kDa之间的分子量；优选的聚乙二醇为， 一端为甲基保护的聚乙 二醇；结构式I式中所述L优选择为O原子或NH原子；其中所述M优选C3 4饱和脂肪烃亚基， 最佳选择为直链亚丙基。本专利技术专利所提及的偶联物的制备方法为，控制缓冲体系的盐浓度范围在 1(Tl00mmol/L之间，优选5(T80mmol/L之间；pH值范围在4. 0 9. 0之间，优选4. 5 6. 5之间； 加入重组人干扰素w与聚乙二醇醛基衍生物反应，控制两反应物的摩尔质量比范围在 0. 25 20之间，优选1.(T10之间；反应时间范围在1 48小时之间，优选8 24小时之间；反 应温度范围在4。C 37。C之间，优选4TT25。C之间；并加入催化量的NaCNBH3作为催化剂，反 应产物经过分于筛色谱、离子交换色谱、疏水层析分离纯化，收集一个聚乙二醇分子连接一 个重组人干扰素w分子的聚乙二醇化重组人干扰素w经过过滤除菌，冷冻干燥后即得。同时 要求一种可用于临床治疗的药物组合物，其中含有有效量的I式偶联物，和药用稀释剂、佐 剂或载体。本专利技术所要解决的再一个技术课题是提供一种上述聚乙二醇化重组人干扰素药物的生产 工艺。结构式I所示偶联物的合成方法是本领域所熟知的，在氰基硼氢化钠存在下，带醛基的 PEG会和伯胺发生还原氨化反应。醛基和其它的亲电活性基团不同，它只和胺基反应。虽然 醛基的反应活性比NHS活性酯低，但是它具有反应条件温和，易于使PEG和蛋白质或其它材料 的表面连接。因此，在较低的pH下，mPEG-醛会对蛋白质的N端进行选择性反应。该反应条件 在pH值4.0-6. 5之间，50-100mmol/L盐浓度的缓冲体系下；温度在4-25'C之间，反应时间为 8-24小时之间；反应摩尔比PEG:rhlFN-w在l:l-10:1之间， 一般情况下，选择低温、低pH值 、反应时间适宜条件下可得到N-末端修饰产物，且反应转化率较高。修饰后的偶联物可以采用阳离子交换色谱纯化。例如，混合物上柱后，用P^4.0 20mM 的醋酸钠淋洗；再用0-lM氯化钠梯度洗脱，pH值可以控制在3-5.5之间，最佳为pH4. 0。收集 到的组分，可以使用质谱、SDS-PAGE等方法通过检测分子量来确认。影响PEG化反应的因素主要有1) pH值；2)温度；3)反应时间；4)蛋白与PEG试剂摩尔 比；5)蛋白浓度。通过控制一个或多个反应因素，我们可以得到所期望的修饰样品反应条件聚合物分子量可以是任意大小，结构的聚乙二醇分子，所选分子量可以是lkDa到大约 lOOkDa(术语大约意指聚乙二醇制品中， 一些分子大于所述分子量，另一些小于所述分子量 )。PEG分子量的选取，取决于所需的治疗方案(例如所需的缓释时间、活性、处理的方便性 、抗原性大小或缺乏以及其它一些PEG对治疗性蛋白质及其类似物的已知效应)。 一般来说 ，聚合物的分子量越大，结合到蛋白质上的聚合物分子数越少。聚合物分子量越高(分枝越 多)，聚合物对蛋白质的比例应越高。反应投料比聚乙二醇分子对蛋白质分子的比例与它们在反应混合物中的浓度一样，可 以改变， 一般来说，聚乙二醇对蛋白质分子的最佳比例(指反应效率而言，即反应混合物中 没有多余未反应的蛋白质及聚合物分子)将根据所选聚乙二醇分子量进行测定。pH会影响到所有的聚合物分子与蛋白质分子的比例， 一般来说，如果反应液pH低于pK， 聚合物分子比例应大大超过蛋白质分子为好；如果pH高于pK，则聚合物对蛋白质分子的比例 不必要太大。反应体系pH值的不本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种化学修饰的干扰素偶联物，其结构如Ⅰ式所示：　Ｒ－Ｌ－Ｍ－ＮＨ－（ｒｈＩＦＮ－ω）　Ⅰ　其中，Ｒ表示具有Ｃ１～４烷烃端基的水溶性聚合物，　Ｌ表示Ｏ、Ｎ、ＮＨ原子，　Ｍ表示Ｃ１～６饱和脂肪烃亚基，　ＮＨ表示ｒ ｈＩＦＮ－ω的Ｎ末端氨基，　ｒｈＩＦＮ－ω表示基因重组人干扰素ω。

【技术特征摘要】
1.一种化学修饰的干扰素偶联物，其结构如I式所示R-L-M-NH-(rhIFN-ω)I其中，R表示具有C1~4烷烃端基的水溶性聚合物，L表示O、N、NH原子，M表示C1~6饱和脂肪烃亚基，NH表示rhIFN-ω的N末端氨基，rhIFN-ω表示基因重组人干扰素ω。2.根据权利要求l所述偶联物，其中所述水溶性聚合物包括聚乙二醇 、聚丙二醇、聚乳酸、聚合氨基酸、分支聚乙二醇、分支聚丙二醇、分支聚合氨基酸等。3.根据权利要求2所述偶联物，其中所述水溶性聚合物为聚乙二醇， 具有在5kDa 100kDa之间的分子量。4.根据权利要求r3所述任一偶联物，其中所述水溶性聚合物的端基为甲基。5.根据权利要求4所述偶联物，其中所述L表示O或NH。6.根据权利要求5所述偶联物，其中所述M表示C3 4饱和脂肪烃亚基。7.根据权利要求5所述偶联物，其中所述M表示直链亚丙基。8.根据权利要求5 7所述任一偶联物的制备方法为，(1) 提供pH4. 0 9. 0、 1(Tl00mmol/L的盐浓度的缓冲体系；(2) 重组人干扰素w与...

【专利技术属性】
技术研发人员：王玉民，严玖凤，李晋峰，陈婷，刘佳，申晓阳，邢娜，
申请(专利权)人：北京凯正生物工程发展有限责任公司，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]