本发明专利技术公开了一种高产甾体发酵金龟子绿僵菌新菌株LJYH201011及其在以沃氏氧化物为底物生产霉菌氧化物中的应用。所述菌株保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心（CGMCC），保藏时间为2011年1月21日，保藏号为：CGMCCNo.4564。本发明专利技术所述的绿僵菌菌株，其用于甾体化合物（薯蓣皂甙）为原料生产植物激素的转化过程中，以沃氏氧化物为底物生产霉菌氧化物。其生产霉菌氧化物具有转化率高（70.86～78.74%）、收率高（100～105%），而且生物学性状比较稳定等特点。本发明专利技术可以为以薯蓣皂甙为原料的植物甾体激素生产提高产量、降低生产成本提供技术支持。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于工业真菌
，具体设计一种高产甾体发酵金龟子绿僵菌菌株及其甾体化合物发酵的应用技术。
技术介绍
1甾体化合物生物发酵甾体化合物是一类含有环戊烷多氢菲核的化合物，由于母核上取代基、双键位置或立体构型的不同，形成了一系列具有独特生理功能的化合物。与甾体化合物有关的激素类药物主要为：1.1 肾上腺皮质激素(Adrenocorticosteroids)：简称皮质激素，包括盐皮质激素(Mineralocorticoids)和糖皮质激素(Glucocorticoids)两类。盐皮质激素在体内主要影响水盐代谢，主要药物为醛固酮(Aldosterone)，临床上主要应用于治疗阿狄森氏内分泌疾病。糖皮质激素，主要影响糖、蛋白质、脂肪和水盐代谢，主要药物有可的松(Cortisone)、泼尼松(Prednisone)、地塞米松(Dexamethasone)，倍他米松(Betamethasone)等，其主要功效为抗炎、抗过敏、免疫抑制，对风湿性、类风湿性关节炎、红斑狼疮等胶原性疾病有明显的治疗作用。1.2 性激素(Sex Hormone)，这类激素包括雌激素(Estrogens)、孕激素(Progestoens)和雄激素(Androgens)。雌激素主要有雌酮(Oestrone)，雌三醇(Estriol)等，孕激素如孕酮(Progesterone)，临床上常用于治疗妇科疾病和骨质疏松等。雄激素如睾酮(Testosterone)，临床上主要用于性机能不全所致的疾病，还可用于治疗贫血、消耗性疾病以及促进骨折和伤口的愈合等。1.3 避孕药物：如乙炔雌二醇，炔诺酮和长效孕酮等。为目前常用的女性用避孕药物。1.4 蛋白同化激素(Anabolic steroids)：主要有17甲基去氢睾丸素(17a-methyldehydro-testosterone)、苯丙酸诺龙(Nandrolonephylpropionate)等，主要用于蛋白质合成不足和分解增加的治疗，如营养不良、严重烧伤、恶性肿瘤、手术后恢复期过长、慢性消耗性疾病以及长期大剂量使用糖皮质激素引起的负氮平衡等。近年来甾体药物的应用领域不断扩大，如用于治疗淋巴白血病、细菌性脑炎、人体器官移植以及和内分泌有关的老年性疾病。另外抗肿瘤、利尿、麻醉、松肌等新药也不断涌现。甾体激素还应用于促进家畜繁殖生长及植物生长。随着甾体药物应用范围的不断扩大，甾体医药产业呈现出很好的发展态势，成为仅次于抗生素的第二大类药物。据统计，80年代初以来，世界甾体药物总产量及销售额以年14%～15%的速度增长，此增长率不低于抗生素、抗感染药物、心血管药物、中枢神经药物和解热镇痛药物。羟化反应是甾体微生物转化中最重要的反应，微生物能在甾体的任何位置进行羟基化反应。化学方法除了较易在C17引入羟基外，在其他位置都很难引入。自1952年Peterson等人最早发现了黑根霉(Rhizopus nigricans)对孕酮的羟化反应后，我国黄鸣-->龙教授等于1958年用黑根霉使16a，17a-环氧黄体酮氧化引入11-a羟基，从而研究成功从薯蓣皂素合成可的松的七步法路线，并一直沿用至今。甾体的微生物羟化反应是利用微生物内的羟化酶对甾体特定部位引入羟基，由于羟化酶的不稳定性，在提取过程中极易失活，因此通常采用微生物菌体细胞转化。转化过程通常分两个阶段。第一阶段是菌体的培养，第二阶段是加入甾体底物进行转化。由于甾体化合物的疏水性，在底物浓度较高时，产物在发酵液中呈结晶析出，属于拟结晶发酵。目前，工业上用于甾体羟化转化反应的微生物主要有黑根霉、赭曲霉(Aspergillusochraceus)以及黄曲霉(Aspergillus flavus)、绿僵菌(Metarhiziumspp.)等。由于绿僵菌性状稳定，转化率和得率较高，近年来在国内成为甾体微生物发酵的新型菌种，具有较大的深度开发应用前景。2 绿僵菌属分类地位及利用现状绿僵菌属(Metarhizium Sorokin)是Sorokin于1883年建立的，它隶属于真菌界（Fungi）、子囊菌门（Ascomycota）、粪壳菌纲（Sordariomycetes）、肉座菌亚纲（Hypocreomycetidae）、肉座菌目（Hypocreales）、麦角菌科（Clavisipitetaceae）。自Sorokin建立绿僵菌属以来，先后发表了10余个种。目前国际上被广泛接受的分类观点是Tulloch建立的分类系统，他将绿僵菌属定为2个种，即金龟子绿僵菌和黄绿绿僵菌，金龟子绿僵菌包括小孢变种和大孢变种。迄今为止，以Driver（2000）等人的研究是最为详尽和完整，基本解决了绿僵菌属中的分类难题。他们将绿僵菌划分为3个种：金龟子绿僵菌、黄绿绿僵菌和白色绿僵菌。该真菌能寄生8个目、30个科共约200余种昆虫，是一种广谱性虫生真菌。目前，绿僵菌多用于生物防治，防治农林业的有害昆虫。绿僵菌在甾体化合物转化上的应用较少，国外未见报道。绿僵菌在液体深层培养中能以微循环产孢方式，即不经营养生长阶段，直接从液生芽孢子上形成液生分生孢子。而这种微循环产孢现象的发生与培养液成分和培养条件密切相关，并与菌株有一定的相关性。环境条件对绿僵菌的生长影响较大，通常在15～35℃条件下都能生长，其中以20～30℃为最适生长温度。菌丝生长和孢子形成的最适温度为25oC；在温度高于40℃ 和低于7～8℃时，分生孢子不萌发。菌丝在30℃条件下生长虽快，但不能很好地形成分生孢子。绿僵菌对湿度的要求更严格，生长发育要求空气相对湿度在93％以上。孢子的存活受物理和化学因素的影响。短时间紫外辐射就可使孢子活力迅速下降，在49℃时只能耐受10分钟。温度与湿度对孢子存活的影响是相关的，在温度20℃、相对湿度为97%的条件下，存活时间可达两年。本专利技术目的提供一种用于甾体发酵生产的金龟子绿僵菌变种（Metarhizium anisopliae var. anisopliae）新菌株LJYH201011，所述菌株保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心（CGMCC），保藏时间为2011年1月21日，保藏号为：CGMCC No.4564，具体内容是：Metarhizium anisopliae var. anisopliae LJYH201011；提供一种高产甾体（薯蓣皂甙）发酵金龟子绿僵菌新菌株，将沃氏氧化物（17α-Eposyprogesterone）作为底物，将其转化为霉菌氧化物（11a-HydroxyEpoxyProgesterone）的应用；-->提供所述高产绿僵菌菌株甾体化合物发酵生产霉菌氧化物的工艺方法。
技术实现思路
本专利技术的金龟子绿僵菌新菌株生物学特征菌株培养性状：在马铃薯琼脂培养基（PDA）上菌落初期为白色绒毛状。27～30℃温度下在室内培养7d，菌落圆形，外圈有时呈轮纹状，直径可达2.0～3.6cm。产孢时由里向外产生污绿色至深绿色分生孢子堆，因为菌落外缘为白色的菌丝，菌落内部为污绿色至深绿色分生孢子堆，菌落呈孔雀斑状。菌株形态特征：菌丝具有分枝分隔，直径1.5～2.4μm。分生孢子梗单生或聚集或紧密排列，帚状分枝或轮生。瓶梗型产孢细胞，2.3～3.0×7.3～7.5μ本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种金龟子绿僵菌菌株，其分类地位为：真菌界、子囊菌门、粪壳菌纲、肉座菌亚纲、肉座菌目、麦角菌科、绿僵菌属；保藏于“中国普通微生物菌种保藏管理中心”，保藏时间为２０１１年１月２１日，保藏号为：ＣＧＭＣＣ Ｎｏ．４５６４。
【技术特征摘要】
1.一种金龟子绿僵菌菌株，其分类地位为：真菌界、子囊菌门、粪壳菌纲、肉座菌亚纲、肉座菌目、麦角菌科、绿僵菌属；保藏于“中国普通微生物菌种保藏管理中心”，保藏时间为2011年1月21日，保藏号为：CGMCC No.4564。2.权利要求1所述的金龟子绿僵菌菌株CGMCC No.4564在以沃氏氧化物为底物生产霉菌氧化物中的应用。3.权利要求1所述的金龟子绿僵菌菌株CGMCC No.4564在以沃氏氧化物为底物生产霉菌氧化物的方法，其特征在于包括以下步骤：3.1原种复活：在27～30℃温度条件下，将保存的原种在PDA培养基试管斜面上培养，直到菌落长满斜面并出现绿色分生孢子堆；3.2制备菌悬液：取无菌水和玻璃珠置入三角瓶中，将培养好的菌种移入三角瓶，将三角瓶在摇床上旋转，再取菌悬液稀释后，涂布在直径为PDA平板上，在27～30℃温度条件下培养；3.3制备试管斜面：在培养的PDA平板上选择单个菌落接种在PDA试管斜面上，在27～30℃温度条件下培养；3.4制备一级种子液：将试管斜面培养的菌种移入已经灭菌的摇瓶培养液中，在27～30℃温度条件下，在摇床上以200～240转/分培养28～30h，获得一级种子液；3.5制备二级种子液：培养基以及装量与上一步相同，在摇瓶中放入玻璃珠，将一级种子液按照20wt%移种量移入二级摇瓶培养，在27～30℃温度条件下，在摇床上以200～240转/分培养14～16h后，即得二级种子液；3.6投料发酵：按照2wt%的投料量投入沃氏氧化物到二级种子液中摇瓶发酵培养，在以上相同条件下，培养48h后得到发酵液；3.7结果检测：将每个摇瓶的发酵液经“煮沸-抽滤-粉碎-加入丙酮蒸发-回流-再抽滤-浓缩-结晶”程序后，将结晶物抽滤得到粗制品和母液，将粗制品烘干称取粗制品重量，根据投料量计算粗制品收率和转化率；3.8选取生产菌株：在收率100%、转化率70%以上的菌株中选择收率和转化率高于平均值的菌株，一方面制成沙土管原种在4℃条件下保存于冰箱中作为原种为以后生产和选育优良菌株备用，另一方面传代用于甾体发酵生产；3.9传代培养：在27～30℃温度条件下，将选取的生...
【专利技术属性】
技术研发人员：周德群，杨晓亮，赵月华，杨毅，王钱钢，
申请(专利权)人：丽江映华生物药业有限公司，
类型：发明
国别省市：53
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