粒细胞集落刺激因子制造技术

本发明专利技术公开了粒细胞集落刺激因子融合多肽；编码所述多肽的核酸分子，以及使用所述蛋白的治疗方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】粒细胞集落刺激因子本专利技术涉及粒细胞集落刺激因子(GCSF)融合多肽及二聚体；编码所述多肽的核 酸分子，以及使用所述蛋白质/ 二聚体的治疗方法。细胞因子受体可分为三种独立的类别。第1类(称之为造血生成素 (haemotopoietin)或生长激素家族)受体的特征是，在它们的胞外结构域的氨基末端部分 中含有4个保守半胱氨酸残基，并且在C末端部分中出现保守的Trp-Ser-Xaa-Trp-Ser基 序。该受体由两条多肽链组成。第1类受体可以细分为GM-CSF亚家族(包括IL-3、IL-5、 GM-CSF、GCSF)和IL-6亚家族(包括IL_6、IL_11和IL-12)。在IL-6亚家族中，具有共同的 转导亚基(gpl30)，该转导亚基与一个或两个不同的细胞因子亚基结合。还有一种亚家族被 称为IL-2亚家族(包括IL-2、IL-4、IL-7、IL-9和IL-15)。在第2类(干扰素受体家族)中也 存在重复的Cys基序，其配体为α、β和Y干扰素，但是缺乏保守的Trp-Ser-Xaa-Trp-Ser 基序。GCSF刺激粒细胞祖细胞的增殖和分化。GCSF由编码来源于不同的mRNA剪切的两 个多肽的单一基因编码。所述多肽的长度为177和180个氨基酸，成熟多肽具有19. 6kD的 分子量。GCSF由内皮和巨噬细胞生成，并且通过在骨髓粒细胞祖细胞上表达的GCSF受体 (GCSFR)起作用，所述骨髓粒细胞祖细胞在活化时导致成熟为粒细胞。然后，它们可以分化 为嗜中性粒细胞前体和成熟的嗜中性粒细胞。重组GSCF的主要治疗应用是在经受癌症化 疗而导致嗜中性粒细胞丢失且随后发展中性粒细胞减少症的患者的治疗中。中性粒细胞减 少症导致免疫抑制，并使患者暴露于感染和败血病。另外，在收集并于造血干细胞移植中使 用之前，使用重组GCSF来增加体内造血干细胞的数量。 本公开内容涉及具有改良的药代动力学(PK)和活性的GCSF重组形式的鉴别。该 新型GCSF分子具有生物活性，形成二聚体并具有改良的稳定性。根据本专利技术的一方面，提供了一种核酸分子，所述核酸分子包含编码具有粒细胞 集落刺激因子活性的多肽的核酸序列，所述多肽包含直接或间接地与粒细胞集落刺激因子 受体多肽的至少一个细胞因子结合结构域相连的粒细胞集落刺激因子多肽。根据本专利技术的一方面，提供了一种融合多肽，所述融合多肽包含直接或间接地与 粒细胞集落刺激因子受体多肽的至少一个细胞因子结合结构域相连的粒细胞集落刺激因 子多肽或其活性部分的氨基酸序列。在本专利技术的一个优选的实施方案中，所述融合多肽包含粒细胞集落刺激因子受体 多肽的两个细胞因子同源结合结构域。在本专利技术的又一个优选的实施方案中，所述融合多肽还含有免疫球蛋白样结构 域。在本专利技术的又一个优选的实施方案中，所述融合多肽包括至少一个纤连蛋白III 结构域；优选地2或3个纤连蛋白III结构域。GCSFR是一种复合体，它含有一系列有助于自身分子结构的结构域。GCSFR可以细 分为若干个从结构和功能上定义的区域。该受体长度为812个氨基酸，并且就其包括细胞 外结构域、单个跨膜结构域和细胞质结构域而言，该受体是典型的细胞因子受体。细胞外结构域具有一种模块式结构，所述模块式结构包含成熟多肽的氨基末端；免疫球蛋白样结构 域(氨基酸1-97)；第一细胞因子同源结构域(97-201)和第二细胞因子结构域(202-313)， 以及三个纤连蛋白III结构域。在功能上，第一和第二细胞因子结构域结合GCSF。在本专利技术的一个优选的实施方案中，所述融合多肽包含SEQ ID NO 31中所表示的 氨基酸残基97-201。在本专利技术的一个备选的优选的实施方案中，所述融合多肽包含SEQ IDNO 31的氨 基酸残基202-313。在本专利技术的一个备选的优选的实施方案中，所述融合多肽含有SEQ IDNO 31的氨 基酸残基97-313。在本专利技术的又一个优选的实施方案中，所述融合多肽含有SEQ IDNO 31的氨基酸 残基1-97。在本专利技术的一个优选的实施方案中，多肽与细胞因子结合结构域相连接，其中在 所述融合多肽中，所述粒细胞集落刺激因子多肽被置于所述细胞因子结合结构域的氨基末端。在本专利技术的一个备选的优选的实施方案中，粒细胞集落刺激因子多肽与细胞因子 结合结构域相连接，其中在所述融合多肽中，所述粒细胞集落刺激因子多肽被置于所述细 胞因子结合结构域的羧基末端。在本专利技术的一个优选的实施方案中，粒细胞集落刺激因子通过肽连接体，优选地 柔性肽连接体与粒细胞集落刺激因子受体多肽的结合结构域相连接。在本专利技术的一个优选的实施方案中，所述肽连接分子包含至少一个拷贝的肽 GlyGlyGlyGlySer0在本专利技术的一个优选的实施方案中，所述肽连接分子包含2、3、4、5、6、7、8、9或10 个拷贝的肽 GlyGlyGlyGlySer。优选地，所述肽连接分子由6个拷贝的肽GlyGlyGlyGlySer组成。在本专利技术的一个备选的实施方案中，所述多肽不含有肽连接分子，而是粒细胞集 落刺激因子多肽和粒细胞集落刺激因子受体多肽的结合结构域的直接融合体。根据本专利技术的一个方面，提供了一种核酸分子，所述核酸分子包含选自如下的核 酸序列i)SEQ ID NO 5中所表示的核酸序列；ii)SEQ ID NO 7中所表示的核酸序列；iii)SEQ ID NO 9中所表示的核酸序列；iv) SEQ ID NO 11中所表示的核酸序列；v) SEQ ID NO 13中所表示的核酸序列；vi) SEQ ID NO 15中所表示的核酸序列；vii) SEQ ID NO 17中所表示的核酸序列；viii) SEQ ID NO 19中所表示的核酸序列；或一种核酸分子，该核酸分子包含在严格杂交条件下与SEQ IDN0:5-SEQ ID NO 19 杂交的核酸序列，并且该核酸分子编码具有粒细胞集落刺激因子受体调节活性的多肽。在本专利技术的一个优选的实施方案中，所述核酸分子编码具有激动剂活性的多肽。在本专利技术的一个优选实施方案中，所述核酸分子编码具有拮抗剂活性的多肽。当两个互补的核酸分子相互之间经受一定数量的氢键合时，发生核酸分子的杂 交。杂交严格性，可根据核酸周围的环境条件、杂交方法的本质，以及所用核酸分子的组成 和长度而发生变化。关于获得特定程度的严格性所需的杂交条件的计算，在以下中进行了 讨论Sambrook 等，MolecularCloning :A Laboratory Manual (分子克隆实验室手册) (Cold Spring HarborLaboratory Press, Cold Spring Harbor, NY,2001)；禾口 Tijssen, LaboratoryTechniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization withNucleic Acid Probes (生物化学和分子生物学实验室技术-与核酸探针杂交)，第一 部分，第二章(ElseviehNew York，1993)。Tm是核酸分子的50%的给定链与其互补链发生 杂交时的温度。下述为杂交条件的示例性设定，但不限于此驢細削牛(介Λ糊辟Φ 90%胃一性請歹斷棘)杂交5XSS本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种核酸分子，其包含编码具有粒细胞集落刺激因子活性的多肽的核酸序列，所述多肽包含直接或间接地与粒细胞集落刺激因子受体多肽的至少一个细胞因子结合结构域连接的粒细胞集落刺激因子多肽。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：彼得阿蒂米克，理查德罗斯，乔恩塞耶斯，
申请(专利权)人：埃斯特瑞恩有限公司，
类型：发明
国别省市：GB[英国]