IX型胶原破坏的诊断制造技术

技术编号:4503350 阅读:215 留言:0更新日期:2012-04-11 18:40
本发明专利技术涉及一种检测或监测蛋白片段存在的方法,该片段在下述新切割位点被切割:IX型胶原alpha 1链N-末端部分附近,接近于NC4结构域,和接近NC3结构域的COL3结构域的C-末端部分。通过切割产生了抗这些新表位的新表位抗体,和在被切割的IX型胶原独特的NC4结构域N-末端部分中的表位。还提供了对实施这些方法有用的诊断试剂盒和抗体。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及通过测定血清和滑液中由IL-1介导的IX型胶原切割片段的水平来检测或监测影响结缔组织紊乱的方法,例如关节病,尤其是骨关节炎、类风湿性关节炎、反应性关节炎、腱断裂、骨质疏松症、骨软化症、骨折修复和动脉硬化。更具体地说,本专利技术涉及检测或监测蛋白片段的存在,该片段是在IX型胶原al链N-末端部分附近的新的切割位点切开,或更确切地,在接近NC4结构域,和接近于NC3结构域的COL3结构域的C-末端部分切开。本专利技术还公开了对抗由切割产生的新表位和在IX型胶原独特的NC4结构域N-末端部分切割的表位的新表位抗体。还提供了对实施这种方法有用的诊断试剂盒和抗体。
技术介绍
在透明软骨IX型胶原中,存在纤维网的次要成分,该纤维网具有作为主要成分的II型胶原。IX型胶原分子是由多肽链al、 oc2和a3组成的异源三聚体(2)。它属于具有间断的三螺旋(FACIT)的原纤维缔合胶原。每条链含有被四个非三螺旋结构域NC1、 2、 3和4环绕的三螺旋(胶原的)结构域COLl、 2和3(3),(也参见图9)。结构域编号从C-末端开始计算。使用电子显微术已经表明IX型胶原修饰II型胶原原纤维的表面,NC4结构域形成球状结构,该球状结构与类似COL3结构域的柱一起从II型胶原纤维伸出(4)。IX型胶原通过与II型胶原和其他类型IX型胶原分子结合而与II型胶原纤维共价交联(5-7)。这些键使得基本不可能用不切割肽键的试剂从成熟软骨中提取IX型胶原。已经表明NC4结构域对很多分子具有亲和力,例如肝素和软骨寡聚基质蛋白(COMP)(8-10),而COL结构域与胞外基质蛋白-3相互作用(11)。已经在一种罕见的遗传性不同种类范围的影响生长和骨骺骨化的疾病-多发性骨骺发育不良患者中发现了相互作用性COMP、MATN-3和COL9中的突变(12)。现在令人惊讶地表明NC4-片段是软骨破坏的生物标志。切割发生在软骨的一种主要结构成分聚集蛋白聚糖释放之后,和主要胶原降解之前。与胶原标志相比,NC4-片段是"不可逆点(point of no return)"之前引起破坏过程的标志,胶原标志类似X线观察是破坏过程晚期的结果。聚集蛋白聚糖相关标志在降解发展早期以及在组织正常适应期间释放,因此不能明确地表示病理过程。此外聚集蛋白聚糖标志常常与炎症相关联。本专利技术描述的切割NC4后,保留与II型胶原交联的大部分IX型胶原可能被进一步切割,并在稍后阶段释放。本专利技术这里公开的对抗所释放片段的新C-末端的新表位抗体可以检测到这种切割。另外,本专利技术公开的新表位抗血清可用在免疫组织化学法中测定软骨中(浅表-深处、细胞周-细胞间)是否发生了这里报道的新切割。最初保留在组织中的新形成的N-末端片段的抗体可以检测这种片段释放的后期。使用co13结构域切割产生的新表位可以获得对时期的更多信息。很多在先出版物和专利申请描述了特异性结合IX型胶原的单克隆抗体,但是他们中无一提及特异性对抗接近NC4的切割位点的新表位抗体。专利申请WO1990008195Al公开了对应于人IX型胶原的片段的寡肽有效作为生产单克隆抗体的抗原,该抗体在免疫原性上结合人IX型胶原和由其衍生的片段。然而该专利申请中提及的片段不涉及IX型胶原的病理破坏,因此预料不到与关节炎相关联。在WO2004110475 Al中,委派了 Inst of Nutraceutical ResearchPTY,该专利技术涉及包含NC4结构域的组合物,用于治疗和耐受诱导具有关节炎症状的个体。该专利技术人还描述了从结缔组织回收具有抗关节炎活性或抗炎活性的多肽的方法。正如上述提及的专利申请,抗体对抗未切割IX型胶原,不是新表位抗体。此外申请人没有提及NC4作为诊断标志。专利申请WO1999021011Al,委派Fibrogen Inc,披露了通过测定血清中IX型胶原水平来检测或监测自身免疫紊乱和结缔组织紊乱的方法。当制备抗IX型胶原的抗体时,选择NC4结构域的N末端部分中的序列。这个抗体对抗未切割IX型胶原且不针对像本专利技术这里的独特的切割新表位。以前文件无一描述NC-4结构域中存在的引起这个结构域专一释放的特异性切割位点。尽管事实上在某些疾病中组织被完全破坏,但是不能推断或预知切割特性。也不能预料牛软骨和人软骨中分子的切割不同,尤其是考虑到序列相似性(图10)。因此,特异性切割位点的发现是新的并开发了新诊断专利技术。因此,我们开发了易感Western印迹技术和敏感抑制ELISA作为鉴定新切割位点的方法,该位点利于分析任何人样品中IX型胶原的破坏,例如滑液、血清、尿和任何体液。这种试验可用于确定所鉴定切割是否出现在患者软骨降解和关节退化中以及何时出现的。通过使用本专利技术这里的特异性新表位抗体,该试验可用于诊断疾病进展和监测疾病对治疗的反应。例如确定运动员治愈骨折重返训练计划的最佳时机。
技术实现思路
白介素-1诱导的牛鼻软骨降解用于在16天的周期内研究组织中分解代谢活动。培养基通过2D电泳(等电点聚焦和SDSPAGE)分级。通过肽质谱指纹分析进行的成分鉴定揭示蛋白片段的释放,例如IX型胶原al链的NC4结构域在第12和16天释放。抗NC4结构域N-末端部分的表位的新肽抗体证实了这个发现并表明在第9天就已经存在一个片段。两个最富足片段的质谱分析揭示最小的片段包含几乎全部的NC4结构域,在序列中精氨酸-258和异亮氨酸-259之间切开,产生C-末端£7UA^i:/Mi - (SEQ ID NO: l)和N-末端-/TPG^T^P (SEQ IDNO: 2)(五rCA^Z層,090//和A^/TPG^i^o较大的片段包含NC4结构域和COL3结构域,切割位点位于 COL3中的甘氨酸-400和苏氨酸-401之间,产生C-末端 i G^尸G7^G尸尸G^5^-(SEQ ID NO: 3)和接近NC3结构域的N-末端 -77G^//ZX £> (SEQ ID NO:4) (KG尸户GPK7m7尸SG柳-CO朋和 -M/2-77Gi^DGDj。在IL-1治疗前或者由于IL-1治疗,多个胶原a 1 (IX) N-末端序列的存在表明所释放分子是在非常接近原始N-末端的 位点被切开的。己经表明(l)基质金属蛋白酶13 (MMP-13)是有活性的且在这个 时间间隔内切割人纤调蛋白。MMP-13处理的软骨移植物显示释放与 IL-1治疗所获得的那些大小相同和切割位点相同的胶原(xl(IX)片段。 提供的数据描述了显然包括MMP-13的潜在重要降解活动,且先于最 终的II型胶原损害。切割人软骨中IX型胶原的进一步研究揭示人IX型胶原al链在 NC-4结构域中也存在特异性切割位点,但是这令人惊讶地发生在不 同于牛胶原的位点。人IX型胶原al链NC-4结构域中 CHELPARITPSQTTDERGPP (SEQ ID NO:5)的谷氨酰胺-263和苏氨 酸-264之间位点的切割产生C-末端CHELPARITPSQ-(SEQ ID NO :6) 和N画末端-TTDERGPP) (SEQ ID NO :7)(-CHELPARITPSQ263-COOH andNH2-TTDERGPP)。 COL3结构域中该位点呈现的较大片段与牛和 人软骨得到的大小相同且切割发生在本文档来自技高网
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【技术保护点】
一种检测或监测影响结缔组织的人紊乱的方法,所述方法包括测定血液和滑液中IX型胶原α-1链的切割蛋白片段的水平。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员:迪克海涅高米卡埃尔丹费尔特帕特里克翁纳福约尔德
申请(专利权)人:安娜玛医药有限公司
类型:发明
国别省市:SE[瑞典]

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