一种聚合酶链式反应检测曲霉菌的方法技术

本发明专利技术公开了一种聚合酶链式反应检测曲霉菌的方法，其步骤是：Ａ、样品的处理：经２％纤维素酶（０．６５ｍｏｌ／ＬＮａＣｌ配制）和２０ｍｇ／ｍｌ蛋白酶Ｋ处理后，于液氮、沸水浴中循环处理；Ｂ、ＰＣＲ体系：将处理后的菌液加入ＰＣＲ反应体系中进行ＰＣＲ扩增；Ｃ、ＰＣＲ产物的检测：对扩增后的ＤＮＡ样品进行琼脂糖凝胶电泳。本发明专利技术方法简便，操作方便，避免了传统曲霉菌ＤＮＡ提取方法中繁琐的物理破除细胞壁的过程，并省去了ＤＮＡ抽提步骤，克服了现有技术中因污染而影响检测结果的不足。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物
，具体涉及一种聚合酶链式反应用于检测曲霉菌的方法。
技术介绍
聚合酶链式反应(PCR)是一种快速简便的体外合成核酸的方法，在医学和生物学 中得到了广泛的应用。常用的PCR检测曲霉菌的方法需要提取待检样品的基因组DNA，然 后取适量的DNA作为模板，再进行相应的聚合酶链式反应。由于曲霉菌的细胞壁富含多糖 (主要由几丁质、甘露聚糖、葡聚糖等组成)，使得一般的酶类不能很好消化去壁、释放DNA。 目前使用的常规方法的技术路线是利用液体培养基培养曲霉菌，收集菌丝，用液氮研磨破 碎细胞壁，再用提取液提取DNA，定量分析确定提取的DNA浓度，取适量的DNA作为模板进行 PCR扩增。目前使用的常规的曲霉菌DNA提取方法耗时长、工作量大，操作过程中易打断基 因组DNA，且容易交叉污染，不适宜大批量标本的快速分析。在一些利用已知序列开展的分 子鉴定、系统进化、抗药性等曲霉菌研究中，往往一次需要检测很多种样品，用常规方法提 取基因组DNA更显得费时费力且成本高。因此，建立一种快速简便的曲霉菌PCR检测方法 十分必要。
技术实现思路
本专利技术的任务是提供，使其具有操作简 便、快速、不受污染、灵敏度高等特点，快速、简便，且实验结果重复性好、特异性高，准确可 靠。避免了传统曲霉菌DNA提取方法中繁琐的物理破除细胞壁的过程，省去了 DNA抽提步 骤，并克服了现有技术中存在的因容易受到污染而影响检测结果的不足，目的在于创建一 种快速简便的聚合酶链式反应检测曲霉菌的方法。 实现本专利技术的技术方案是 本专利技术提供的这种聚合酶链式反应检测曲霉菌的方法，包括以下步骤 A.将待检样品依次用纤维素酶和蛋白酶K处理，以破坏待检样品中所含曲霉菌的细胞壁； B.加入1 % TritonX-100，置于液氮中冷冻，再置于沸水中加热，重复此冷冻和加 热过程，使待检样品中所含曲霉菌之DNA得以释放； C.取经过步骤A和步骤B处理过的样品3 ill 15 ill直接作为模板，加入PCR反应体系中，用曲霉菌通用弓I物或曲霉菌特异性引物进行聚合酶链式反应扩增； D.对扩增后的DNA样品进行O. 8% 1 %琼脂糖凝胶电泳，在与所用引物相应的预期条带范围内检测到扩真增条带，即可确定样品中含有曲霉菌或确定菌种。 上述步骤A所述的将待检样品依次用纤维素酶和蛋白酶K处理，以破坏待检样品中所含曲霉菌的细胞壁的具体方法是取待检样品，放入离心管中，按待检样品的重量g与2%纤维素酶的体积ml比为1 : 2 6的比例加入2%纤维素酶，于37t:放置1 3小时，3按待检样品的重量g与浓度为20mg/ml蛋白酶K的体积ml比为1 : 0. 2 0. 6的比例加 入浓度为20mg/ml蛋白酶K，于55"放置1 2小时； 上述步骤B所述的加入1% TritonX-100，置于液氮中冷冻，再置于沸水中加热，重复此冷冻和加热过程，使待检样品中所含曲霉菌之DNA得以释放的具体方法是加入1% TritonX-100，将该离心管放入液氮中冷冻lmin，插入沸水中lmin，再放入液氮中冷冻lmin，插入沸水中lmin，再放入液氮中冷冻1分钟，最后插入沸水中lOmin ; 上述步骤C所述的将经过步骤A和步骤B处理过的待检样品直接作为模板，用曲霉菌通用引物或曲霉菌特异性引物进行聚合酶链式反应扩增的具体方法是94t:预变性4分钟;94。C变性30秒，55。C退火30秒，72。C延伸1分钟，35个循环；最后72。C延伸10分钟; 本专利技术方法中聚合酶链式反应反应液的体系是25uL。 实验资料 1、曲霉菌菌丝的处理 取曲霉菌菌丝于离心管中，加入2 6ml/g的2X纤维素酶(用浓度为0. 65mol/L 的NaCl配制)，37。C烘箱处理3小时，然后加入0. 2 0. 6ml/g的20mg/ml蛋白酶K， 55。C水 浴2小时后，加入1% TritonX-100，将该离心管放入液氮中冷冻lmin，插入沸水中lmin，再 放入液氮中冷冻lmin，插入沸水中lmin，再放入液氮中冷冻l分钟，最后插入沸水中10min。 将混合液直接作为模板用于PCR反应。 2、处理后的曲霉菌直接作为模板的聚合酶链式反应 取处理后的菌液3 ii 1作为模板加入PCR反应体系中进行PCR扩增。 按照已有的常规PCR扩增程序，设定如下 首先模板94。C变性4分钟；接着35个循环，每个循环包括94。C变性30秒，55°C 退火30秒，72。C延伸1分钟。 最后72t:延伸IO分钟。 PCR产物的检测 对扩增后的DNA样品使用1 %的琼脂糖凝胶进行电泳，检查扩增条带，并用传统方法提取的曲霉菌DNA扩增产物作为对照，以检测该方法进行扩增反应的可行性。 所述PCR体系参见各种商业聚合酶说明书，以FERMENTAS(MBI)公司Taq酶为例，PCR体系的组成为 <table>table see original document page 4</column></row><table>T叫酶1U菌液3u LddH20补足总体积为25 u L 所述的聚合酶链式反应(PCR)体系包括脱氧核糖核苷酸、耐热DNA聚合酶、模板 DNA和缓冲液，聚合酶链式反应反应液的总体积是25 L。 本专利技术与现有技术相比具有以下优点和效果 处理曲霉菌后，直接取溶液替代提取待测基因组DNA作为PCR反应的模板，避免了 传统的曲霉菌DNA提取方法中繁琐的物理破除细胞壁的过程，省去了 DNA抽提步骤。在曲 霉菌菌种的鉴定中，大大縮短了检测时间(本专利技术方法检测时间约为4-5小时，而传统方法 则需要6-8小时)、大幅度降低了试验成本，减少了污染的可能性。本方法不仅快速、简便， 且实验结果重复性好、特异性高，准确可靠。附图说明 图1为以本专利技术方法检测黑曲霉的PCR扩增图，图1中M为DL2000Marker，第一道 为用本专利技术方法处理后的黑曲霉菌丝溶液直接进行PCR扩增的产物，第二道为阳性对照， 即用常规方法提取黑曲霉DNA的扩增产物，第三道为阴性对照，第四道为空白对照。 图2为不同浓度黑曲霉菌丝溶液的PCR扩增图，图2中M为DL2000Marker，第一 道至第四道分别为取0. 004g、0. 01g、0. 04g、0. 07g菌丝处理后进行PCR反应的结果，第五道 为阳性对照，可见第一道无条带，即没有DNA释放，第二、三道条带较淡，第四道条带清晰， 表示随着菌丝量的增多，释放的DNA增多，扩增条带更加清晰，当菌丝量高于0. Olg即可扩 增出产物。具体实施例方式下面结合具体实施例，进一步阐述本专利技术。实施例 —、黑曲霉的处理 1、标准黑曲霉菌株接种察氏培养基37t:培养3天，挑取菌落接种于LB液体培养 基，37t:振荡过夜，收集菌丝。称取0.05g菌丝于1.5ml塑料离心管中，加入200uL 2%纤维 素酶(0. 65mol麵Cl配制)，37。C烘箱处理3小时后，加入20uL 20mg/ml蛋白酶K， 55。C水 浴2小时后，加入1% TritonX-lOO。将该离心管放入液氮中冷冻lmin，插入沸水中lmin，再 放入液氮中冷冻lmin，插入沸水中lmin，再放入液氮中冷冻1分钟，最后插入沸水中10本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种聚合酶链式反应检测曲霉菌的方法，包括以下步骤：　　Ａ．将待检样品依次用纤维素酶和蛋白酶Ｋ处理，以破坏待检样品中所含曲霉菌的细胞壁；　　Ｂ．加入１％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００，置于液氮中冷冻，再置于沸水中加热，重复此冷冻和加热过程，使待检样品中所含曲霉菌之ＤＮＡ得以释放；　　Ｃ．取经过步骤Ａ和步骤Ｂ处理过的样品３μＬ～１５μＬ模板，加入ＰＣＲ反应体系中，用曲霉菌通用引物或曲霉菌特异性引物进行聚合酶链式反应扩增；　　Ｄ．对扩增后的ＤＮＡ样品进行０．８％～１％琼脂糖凝胶电泳，在与所用引物相应的预期条带范围内检测到扩真增条带，即可确定样品中含有曲霉菌或确定菌种。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：周东风，肖晶，孟浦，李立家，
申请(专利权)人：华中科技大学同济医学院附属协和医院，
类型：发明
国别省市：83[中国|武汉]