个体ＲＨＤ基因合子型测定的ＰＣＲ引物及试剂盒及测定方法技术

本发明专利技术为一种个体ＲＨＤ基因合子型测定的ＰＣＲ引物及试剂盒及测定方法。本发明专利技术的引物用于检测ＲＨＤ基因的第一外显子，其上游引物的３’端位置是在相对ＲＨＤ基因编码区第一个碱基位置的－５５４位碱基处，下游引物的３’端位置是在ＲＨＤ基因第一内含子的第１８位碱基处。基于该特异性寡核苷酸引物的本发明专利技术的试剂盒及测定方法，具有先进性、特异性和高准确率，而且在测定时简便和易于操作。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及用于个体RHD基因合子型测定或RHD基因数目测定的PCR引物，及用于个体RHD基因合子型测定或PHD基因数目测定的试剂盒、及个体RHD基因合子型测定或RHD基因数目测定的方法。
技术介绍
2000年德国Wagner等发现在PHD基因两侧各有一段高度同源的序列，约9000bp，在RHD基因5'-端称为上游Rh盒子，3'-端称为下游Rh盒子。RHD阴性单倍体的RHD基因缺失即发生在上、下游盒子之间，并形成一个融合Rh盒子。根据这一原理，RHD(+)/RHD(+)和RHD(-)/PHD(-)纯合体分别拥有上、下游Rh盒子以及仅拥有融合Rh盒子，而PHD(+)/PHD(-)杂合体则同时拥有三种Rh盒子。 Rh血型D抗原(D抗原在红细胞膜表达与否定义为Rh阳性或Rh阴性)是引起严重新生儿溶血病的主要红细胞抗原，编码D抗原的基因为RHD基因，一般一名Rh阳性个体拥有一条RHD基因或二条RHD基因 ， Rh阴性个体则缺失RHD基因。以往RHD基因数目或RHD合子型测定主要是根据Rh小因子表型估计，或通过复杂的家系调查，或根据RhD抗原的量等间接方法鉴别，2000年国际上建立了第一个RHD基因合子型直接测定技术，为限制性片段长度多态性(RFLP)方法，该方法采用一对PCR引物同时扩增下游和融合Rh盒子，然后采用限制性内切酶作酶切，再电泳分析片段大小多态性，一次实验结果可以判断三种RHD合子型，但是该方法操作复杂、耗时较长。2001年和2002年，中国香港学者和奥地利学者分别独立报道了采用扩增突变阻滞检测系统和实时聚合酶链式反应(Real-time PCR)技术检测已知Rh阳性表型个体的RHD基因数目，该技术同样较为复杂且要求特殊的仪器，而且不能区分RHD (+) /RHD (-)和RHD (-) /RHD (-)合子型。2003年本专利专利技术人之一邵超鹏等设计建立了简易的聚合酶链式反应(PCR)检测方法，一次可判断三种RHD合子型，但是在随后的应用中发现由于引物位置和反应区域等原因，造成存在一定比率的假阳性和假阴性现象。
技术实现思路
本专利技术的第一个目的是针目前国内外个体PHD基因合子型测定或RHD基因数目测定的方法存在的上述各种问题，提供特异性的用于个体RHD基因合子型测定的PCR引物。 本专利技术的第二个目的是采用本专利技术的特异性PCR引物，提供一种能克服之前方法复杂或需特殊仪器设备等局限性，能降低之前方法存在的假阳性或假阴性率，能准确进行3个体PHD基因合子型测定或PHD基因数目测定的试剂盒。 本专利技术的第三个目的是采用本专利技术的试剂盒，提供一种操作简便的个体RHD基因合子型测定方法。 本专利技术的目的是这样实现的 本专利技术的个体RHD基因合子型测定或RHD基因数目测定技术采用序列特异性引物-聚合酶链式反应技术，(sequence specificprimer-polymorase chain reaction,縮写PCR-S SP或S SP-PCR或PCR/SSP)，聚合酶链式反应又称体外扩增技术，序列特异性引物_聚合酶链式反应技术是其一种方式，也有称为等位基因特异性或核甘酸特异性的PCR技术。 我们根据美国国家生物信息中心(NCBI)GenBank记录的基因序列或核酸序列，确定了二对特异性寡核苷酸引物，用于个体RHD基因合子型测定或RHD基因数目测定。 本专利技术的二对特异性寡核苷酸引物分别如下 (1)上游引物Hy-s :其3，端位置是在Rh融合盒子(hybrid Rhesusbox，序列见NCBI GenBankAJ252313)第4988位碱基处；下游引物Hy-a :其3'端位置是在Rh融合盒子第7710位碱基处； (2)上游引物Dl-s :其3'端位置是在相对RHD基因编码区第一个碱基位置的-554位碱基处(序列见NCBI GenBank AJ252314);下游引物Dl_a :其3'端位置是在RHD基因第一内含子的第18位碱基处。 上述每段特异性寡核苷酸引物的长度为21-28个核苷酸。引物序列以靠近3'端的4-5个碱基决定其反应特异性，靠近5'端的碱基可根据情况增加或较少。 上述二对特异性寡核苷酸引物使用如下序列较佳 (1)上游引物Hy-s :5， -TGAGCCTATAAAATCCAAAGCAAGTTAG-3，，下游引物Hy-a :5，-CCTTTTTTTGTTTGTTTTTGGCGGTGC-3，， (2)上游弓|物Dl-s :5' -TCAACTGTGTAACTATGAGGAGTCAG-3，，下游引物Dl_a :5， -GCTATTTGCCTGTGACCACTT-3，。 上述较佳引物的核苷酸序列及所处的位置请见如下表1 :<table>table see original document page 4</column></row><table> 表1 表1中"IC"为一对内对照引物，检测人类血小板抗原，"基因序列"为在美国国家生物信息中心(NCBI)GenBank进行登记的基因序列编号，"bp"表示扩增产物的碱基长度。 采用本专利技术的上述特异性寡核苷酸引物，制备成本专利技术的用于个体RHD基因合子型测定或RHD基因数目测定的试剂盒。 本专利技术的用于个体RHD基因合子型测定或PHD基因数目测定的试剂盒，包含本发 明的上述一对或二对特异性寡核苷酸引物。当试剂盒包含本专利技术的第一对特异性寡核苷酸 引物时，可用来鉴别RHD (+) /RHD (+)与RHD (+) /RHD (-)，或鉴别RHD (+) /RHD (+)与RHD (-) / RHD(-)合子型；当试剂盒包含本专利技术的第二对特异性寡核苷酸引物时，鉴别RHD(-)/ RHD (-)与RHD (+) /RHD (+)，或鉴别RHD (-) /RHD (-)与RHD (+) /RHD (-)合子型。当试剂盒包 含本专利技术的两对特异性寡核苷酸引物时，可一次判断三种RHD基因合子型，即一次测定个 体是三种中的哪一种RHD基因合子型。 本专利技术的试剂盒可以是仅包含一对或二对特异性寡核苷酸引物，还可以包含有 PCR扩增反应液。二对引物可装于同一容器内，也可分别装于二个容器内，分别装于二个容 器内较佳。当二对特异性寡核苷酸引物分别装于二个容器时，每个容器内的PCR扩增反应 液包含:PCRBuffer、MgCl22. 5mM、dNTPs200 ii M、甘油5% (v/v)、甲酚红0. 005% (w/v)，其余 为纯水，特异性寡核苷酸引物的浓度为0. 6pmol/y L，。 本专利技术的试剂盒还可包含有内对照引物，例如表1中所示的内对照引物IC。 本专利技术的试剂盒还可包含有DNA聚合酶。 上述的PCR扩增反应液、内对照引物可装在或不装在包含有本专利技术的特异性寡核 苷酸引物的每个容器内。 采用本专利技术的试剂盒对个体PHD基因合子型或RHD基因数目进行测定，该方法包 括如下顺序的步骤 (1)试剂盒的准备试剂盒包含两种RHD基因检测用PCR测定混合液，分装于2个 容器内，每种测定混合液包含有PCR Buffer、 MgCl22. 5mM、 dNTPs200 ii M、甘油5% (v/v)、 甲酚红0. 005% (w/v)、权利要求本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于个体ＲＨＤ基因合子型测定的ＰＣＲ引物，为如下一对特异性寡核苷酸引物：　　上游引物Ｄ１－ｓ：其３’端位置是在相对ＲＨＤ基因编码区第一个碱基位置的－５５４位碱基处；　下游引物Ｄ１－ａ：其３’端位置是在ＲＨＤ基因第一内含子的第１８位碱基处；　　上述每段特异性寡核苷酸引物的长度为２１－２８个核苷酸。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：邵超鹏，
申请(专利权)人：深圳市血液中心，
类型：发明
国别省市：94[中国|深圳]