一种检验葡萄糖氧化杆菌催化能力的方法技术

技术编号:4273228 阅读:191 留言:0更新日期:2012-04-11 18:40
本发明专利技术属于微生物工程领域,具体涉及生产米格列醇过程中检验葡萄糖氧化杆菌催化能力的检测方法,包括摇瓶生物转化过程、硅胶板层析和显色过程。本发明专利技术操作简单、易行,对生产、研究很有意义。既可以用于出发菌株的催化能力检测,优选菌株,又可用于发酵结束菌丝体的催化能力的检验,指导生产,极有应用价值。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于微生物工程领域,具体涉及生产米格列醇过程中检验葡萄糖氧化杆菌催化能 力的检测方法。
技术介绍
米格列醇(miglitol)是拜耳公司在1997年度上市的新型抗糖尿病药物。它是从杆菌肉 汤培养基中发现的一种新型肠道a-葡萄糖苷酶抑制剂,是1-脱氧野尻霉素的母体修饰产物, 属于N-取代-l-脱氧野尻霉素类型,结构与葡萄糖相似。尽管用化学合成的方法能够制备米 格列醇,但化学合成法制备米格列醇的步骤较多,米格列醇分子中含有的四个手性中心也给 化,合成带来了很大的困难。目前生产规模大多采用生物合成来制备米格列醇。米格列醇的生物合成法据文献报道大致有二条路线一是先由野尻霉素或1-脱氧野尻霉素产生菌生物发 酵,制备获得野尻霉素或1-脱氧野尻霉素,然后再经过化学合成方法获得米格列醇,这是最原始的途径;二是应用氧化葡糖酸菌转化制备米格列醇关键中间体N-取代-l-脱氧野尻霉素,其主要通过化学合成-生物转化-化学合成的方法来制备。US4266025, EP0477160, USP2001/0019837公布了另外的米格列醇的生产方法,即化学 合成结合生物催化的方法。但由于菌体活力不高,导致生物催化时间过长,造成生产成本高, 生产周期长,给工业化生产带来很大的障碍。由于微生物酶的高效专一性,省略了化学合成过程中为达到专一地改造某个目的基团必 须进行的加入和脱除保护基团的步骤,大大简化了制备过程,提高了反应收率。氧化葡糖酸 杆菌用于转化特定底物制备1-脱氧野尻霉素及其衍生物具有很多优点l)转化液经离心除去 菌体,无需分离纯化出中间体,就可进行下一步合成。2)无需基团保护,成本大大降低,且 避免因去除保护剂而造成的回收率下降。3)中间体6-(取代胺基)-6-脱氧_ a -L-山梨呋喃糖 具有较高的溶解度和稳定性,不易被降解。但对于转化机理的报道还没有,可以肯定的是, 葡萄糖氧化杆菌中含有参与该转化反应的生物酶或酶系,葡萄糖氧化杆菌的催化能力与其含 有的生物酶系的数量和活力有直接关系。目前还没有有关检验菌体催化能力的方法的相关报道,同样也没有关于葡萄糖氧化杆菌 催化能力的方法研究和结果判断方法的相关报道。
技术实现思路
在发酵生产米格列醇过程中,常常由于葡萄糖氧化杆菌的催化能力低下,导致最终的发 酵单位低,生产成本高。为了避免种子的催化能力低下导致发酵成本高的风险,本专利技术提出 。根据此方法,判断菌体催化能力是否适合大生产 需要,降低了生产中催化反应不完全的风险。为了达到专利技术目的,专利技术人提出了检验葡萄糖氧化杆菌催化能力的方法,包括摇瓶生物 转化过程、硅胶板层析和显色过程。具体地,本专利技术的检测方法包括如下步骤1) 将N- (2-羟乙基)-葡糖胺用纯化水溶解,加入葡萄糖氧化杆菌的菌丝体,放入恒温 振荡培养箱中转化;2) 将转化液离心,取上清液点样硅胶极,以甲醇-乙醇-氨水为层析液进行层析,然后干 燥硅胶板进行碘显色。优选地,上述l)步骤中N- (2-羟乙基)_葡糖胺在水中的重量百分比浓度为2% 8%, pH为4.5 6.5,菌丝体与N- (2-羟乙基)-葡糖胺的重量比为1 5: 1,其转化的条件为 恒温振荡培养箱的转速为250rpm,温度为20。C,转化15小时;优选地,上述2)步骤中甲醇 -乙醇-氮水的体积比为1 3: 1 3: 1 3,甲醇、乙醇、氨水都为分析纯,其中,氨水浓度 为25-28%。在具体应用过程中,可以选取具体实施方式中的某一实施例,对不同批次菌丝体的催化 能力应用本方法进行检测、分析,如果某一批次菌丝体催化能力明显低于正常值,则说明本 批次菌丝体发酵过程控制不当,不能用来做生产。.本专利技术操作简单、易行,对生产、研究很 有意义。既可以用于出发菌株的催化能力检测,优选菌株,又可用于发酵结束菌丝体的催化 能力的检验,指导生产,极有应用价值。具体实施例方式实施例1(1) 精确称量底物(N- (2-羟乙基)-葡糖胺)l.O克,放入500毫升摇瓶中,用49毫 升纯化水溶解,使底物重量百分比为2%,以浓盐酸调节pH值至6.5,加入葡萄糖氧化杆菌 的菌丝体5克,使菌丝体和所转化底物的重量比为5: 1,放入恒温振荡培养箱中,在转速为 250rpm,温度为2(TC的条件下,转化15小时。(2) 将上述步骤中的转化液离心去除菌丝体,上清液取样,以2%的底物为对照品,在4硅胶板上点样,以吹风机干燥点样点后放入盛有少量体积比为1:1:1的甲醇一乙醇一氨水 层析液的层析缸中,层析约20分钟,干燥硅胶板,放入碘瓶中显色。显色两分钟后,根据显 色情况,判断转化约为90%。实施例2(1) 精确称量底物(N— (2—羟乙基) 一葡糖胺)1.0克,放入500毫升摇瓶中,用49 毫升纯化水溶解,使底物重量百分比为2%,以浓盐酸调节pH值至6. 0,加入葡萄糖氧化杆 菌的菌丝体4克,使菌丝体和所转化底物的重量比为4: 1,放入恒温振荡培养箱中,在转速 为250rpm,温度为20'C的条件下,转化15小时。(2) 将上述步骤中的转化液离心去除菌丝体,上清液取样,以2%的底物为对照品,在 硅胶板上点样,以吹风机干燥点样点后放入盛有少量体积比为2: 2: 1的甲醇一乙醇一氨水 层析液的层析缸中,层析约20分钟,干燥硅胶板,放入碘瓶中显色。显色两分钟后,根据显 色情况,判断转化约为85%。实施例3(1) 精确称量底物(N— (2—径乙基) 一葡糖胺)2.0克,放入500毫升摇瓶中,用48 毫升纯化水溶解,使底物重量百分比为4%,以浓盐酸调节pH值至5.5,加入葡萄糖氧化杆 菌的菌丝体6克,使菌丝体和所转化底物的重量比为3: 1,放入恒温振荡培养箱中,在转速 为250rpm,温度为2(TC的条件下,转化15小时。(2) 将上述步骤中的转化液离心去除菌丝体,上清液取样,以4%的底物为对照品,在 硅胶板上点样,以吹风机干燥点样点后放入盛有少量体积比为3: 1: 1的甲醇一乙醇一氨水 层析液的层析缸中,层析约20分钟,干燥硅胶板,放入碘瓶中显色。显色两分钟后,根据显 色情况,判断转化约为81%。实施例4(1) 精确称量底物(N— (2—轻乙基) 一葡糖胺)3.0克,放入500毫升摇瓶中,用47 毫升纯化水溶解,使底物重量百分比为6%,以浓盐酸调节pH值至6. 0,加入葡萄糖氧化杆 菌的菌丝体6克,使菌丝体和所转化底物的重量比为2: 1,放入恒温振荡培养箱中,在转速 为250rpm,温度为20'C的条件下,转化15小时。(2) 将上述步骤中的转化液离心去除菌丝体,上清液取样,以2%的底物为对照品,在风机干燥点样点后放入盛有少量体积比为1: 3: 3的甲醇一乙醇一氨水 层析液的层析缸中,层析约20分钟,干燥硅胶板,放入碘瓶中显色。显色两分钟后,根据显 色情况,判断转化约为72%。实施例5(1) 精确称量底物(N— (2 —羟乙基) 一葡糖胺)4.0克,放入500毫升摇瓶中,用46 毫升纯化水溶解,使底物重量百分比为8%,以浓盐酸调节pH值至5.0,加入葡萄糖氧化杆 菌的菌丝体4克,使菌丝体和所转化底物的重量比为1: 1,放入恒温振荡培养箱中,在转速 为250rpm,温度为20'C的条件下,转化15小时。(2) 将上述步骤中的转化液离心去除菌丝体,上清液取样本文档来自技高网
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【技术保护点】
一种检验葡萄糖氧化杆菌催化能力的方法,包括如下步骤: 1)将N-(2-羟乙基)-葡糖胺用纯化水溶解,加入葡萄糖氧化杆菌的菌丝体,放入恒温振荡培养箱中转化; 2)将转化液离心,取上清液点样硅胶板,以甲醇-乙醇-氨水为层析液进行层析,然后干燥硅胶板进行显色。

【技术特征摘要】
1.一种检验葡萄糖氧化杆菌催化能力的方法,包括如下步骤1)将N-(2-羟乙基)-葡糖胺用纯化水溶解,加入葡萄糖氧化杆菌的菌丝体,放入恒温振荡培养箱中转化;2)将转化液离心,取上清液点样硅胶板,以甲醇-乙醇-氨水为层析液进行层析,然后干燥硅胶板进行显色。2. 如权利要求l所述的方法,其特征在于,所述步骤l)中N- (2-羟乙基)-葡糖胺在水中 的重量百分比浓度为2% 8%, pH为4.5 6.5。3. 如权利要求l所述...

【专利技术属性】
技术研发人员:赵志全
申请(专利权)人:鲁南制药集团股份有限公司
类型:发明
国别省市:37[中国|山东]

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