本发明专利技术提供了核糖核酸酶（Ｏｎｃ）与细菌毒蛋白膜转位结构域的融合蛋白，编码该融合蛋白的ＤＮＡ序列，含该ＤＮＡ序列的载体，含该载体的宿主细胞，用基因工程制备该融合蛋白的方法。本发明专利技术的融合蛋白既保有原来的Ｏｎｃ的活性，又具有更强的杀死肿瘤细胞的能力，可以更广谱地用于抗肿瘤治疗。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于DNA重组技术和生物医药领域。更具体地，本专利技术涉及核糖 核酸酶与细菌毒蛋白(毒素)膜转位结构域的融合蛋白，编码该融合蛋白的DNA 序列，含该DNA序列的载体，含该载体的宿主细胞，利用基因工程技术制备 该融合蛋白的方法，以及该融合蛋白在肿瘤治疗方面的应用。
技术介绍
核糖核酸酶(Onconase又称P30蛋白，Ranpirnase，简称Onc)是从北方豹 蛙(Rana pipiens)的卵母细胞和早期胚胎中分离得到的一种核酸酶，属于RNase A超家族。研究表明Onc通过胞吞作用进入哺乳动物细胞，在胞浆内选择性地 降解tRNA，抑制蛋白质生物合成进而抑制细胞增殖和引起细胞凋亡。体外实 验表明，Onc对多种肿瘤细胞具有抗增殖和细胞毒性作用，如人的恶性间皮 细胞瘤，非小细胞肺癌，前列腺癌细胞、胰腺癌细胞和白血病细胞等。小鼠模 型的体内实验证明，Onc可以抑制肿瘤生长，延长小鼠存活时间，增强多种抗 肿瘤药物的效果。目前，One作为一种抗恶性间皮细胞瘤的药物已经进入三期 临床，是一种具有良好前景的抗肿瘤药物。最近，美国和澳大利亚已批准 Onconase作为非常见病药物(Orphan Drug)投放市场。然而，进一步的研究发现，不同肿瘤细胞对One的敏感性不同(Ulrich Arnold & Renate Ulbrich陽Hofmann. Natural and engineered ribonucleases as potential cancer therapeutics. Biotechnol Lett (2006) 28: 1615-1622)。这大大限制 了 Onc在肿瘤治疗中的适用范围。因此，本领域需要进一步开发具有更好的抑制肿瘤效果且广谱性更强的抗 肿瘤药物。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供核糖核酸酶与细菌毒蛋白膜转位结构域的融合蛋白，编码该融合蛋白的DNA序列，含该DNA序列的载体，含该载体的宿主细胞， 利用基因工程制备该融合蛋白的方法，以及该融合蛋白在肿瘤治疗方面的应 用。在本专利技术的第一方面，提供一种融合蛋白，所述的融合蛋白包括-(1) 核糖核酸酶(Onc);(2) 细菌毒蛋白的膜转位结构域；(3) 位于(1)和(2)之间的由0-50个(较佳地为5-30个，更佳的为10-20个) 氨基酸构成的连接肽。在另一优选例中，所述的核糖核酸酶位于融合蛋白的氨基端；所述的细菌 毒蛋白的膜转位结构域位于融合蛋白的羧基端。在另一优选例中，所述的细菌毒蛋白的膜转位结构域位于融合蛋白的氨基 端，所述的核糖核酸酶位于融合蛋白的羧基端。在另一优选例中，所述的融合蛋白基本上由(l)、 (3)、 (2)相连接而构成。 更佳地，所述的融合蛋白由(l)、 (3)、 (2)相连接而构成。在另一优选例中，所述的连接肽的序列中包括至少一个胞内蛋白酶的酶切 位点序列，从而在进入胞内后将(1)和(2)分离。在另一优选例中，所述的酶切位点序列不存在于核糖核酸酶序列或细菌毒 蛋白的膜转位结构域序列上。在另一优选例中，所述的胞内蛋白酶是特异性位于细胞内的蛋白酶。在另一优选例中，所述的胞内酶选自(但不限于)Furin、基质金属蛋白酶、 前列腺特有抗原和组织蛋白酶。在另一优选例中，所述的融合蛋白在进入细胞后被胞内酶酶切。在另一优选例中，所述的细胞毒蛋白选自(但不限于)白喉毒素(DT)或绿 脓杆菌外毒素A(PE)。在另一优选例中，所述的白喉毒素的膜转位结构域是(a) 如SEQIDNO: 2中第121-308位的氨基酸序列的蛋白；或(b) 将(a)所限定的蛋白的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、 缺失或添加而形成的，且具有(a)所限定的蛋白功能的由(a)衍生的多肽；和/或所述的核糖核酸酶是(al)如SEQ ID NO: 2中第1-104位所示的氨基酸序列(较佳地由SEQ IDNO:2中第l-104位的氨基酸序列构成)；或(bl)将(al)所限定的蛋白的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取 代、缺失或添加而形成的，且具有(al)所限定的蛋白功能的由(al)衍生的多肽； 禾口/或所述的连接肽具有SEQ ID NO: 2中第105-120位所示的氨基酸序列(较佳 地由SEQ ID NO: 2中第105-120位的氨基酸序列构成)。较佳地，所述的融合蛋白具有SEQ ID NO: 2所示的氨基酸序列。在本专利技术的第二方面，提供一种核酸分子，所述的核酸分子编码所述的融 合蛋白。在另一优选例中，所述的核酸分子具有SEQIDNO: 1所示的核苷酸序列。在本专利技术的第三方面，提供一种载体，它含有所述的核酸分子。在本专利技术的第四方面，提供一种基因工程化的细胞，所述的细胞含有所述 的载体；或所述的细胞基因组中整合有所述的核酸分子。在本专利技术的第五方面，提供一种产生所述的融合蛋白的方法，所述的方法 包括(A) 培养所述的宿主细胞，从而表达所述的融合蛋白；(B) 分离出所述的融合蛋白。在本专利技术的第六方面，提供所述的融合蛋白的用途，用于制备抑制肿瘤细 胞生长或治疗肿瘤的组合物。所述的肿瘤选自(但不限于)恶性间皮细胞瘤； 肺癌；白血病；恶性淋巴瘤；骨髓瘤；恶性黑色素瘤；乳腺癌；神经系统肿瘤； 肝癌；鼻咽癌；食管癌；胃癌；结肠癌；前列腺癌；宫颈癌；口腔癌；唾液腺 肿瘤；鼻腔与鼻旁窦恶性肿瘤；喉癌；耳部肿瘤；眼部肿瘤；甲状腺肿瘤；纵 隔肿瘤；胸壁；胸膜肿瘤；小肠肿瘤；胆道肿瘤；胰腺与壶腹周围肿瘤；肠系 膜与腹膜后肿瘤；肾脏肿瘤；肾上腺肿瘤；膀胱肿瘤；前列腺癌；睾丸肿瘤； 阴茎癌；子宫内膜癌；卵巢恶性肿瘤；恶性滋养细胞肿瘤；外阴癌与阴道癌； 软组织肿瘤；骨肿瘤；或皮肤及附件肿瘤。在本专利技术的第七方面，提供一种抑制肿瘤细胞生长或治疗肿瘤的组合物， 所述的组合物含有(i) 有效量的所述的融合蛋白；和(ii) 药学上可接受的载体。 在另一优选例中，所述的组合物是药物组合物。另一方面，还提供一种抑制(如体外抑制)肿瘤细胞生长的方法，所述的方 法包括利用所述的融合蛋白处理肿瘤细胞。本专利技术的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而 易见的。附图说明图1显示了含ONC-DT融合蛋白基因的大肠杆菌表达质粒pET22b-ONC-DT加.39o的示意图。图2显示了本专利技术Onc-DT203-39o的表达纯化效果蛋白SDS-PAGE电泳图。 其中，泳道l.蛋白分子量标准；泳道2.诱导前菌体总蛋白；泳道3.诱导3h后菌体总蛋白；泳道4.诱导后菌体包涵体；泳道5.复性并纯化后Onc-DT2Q3-390。图3显示了 MTT法测Onc-DT203.39o对小鼠骨髓瘤细胞SP2/0和人类白血 病细胞K562的细胞毒性效果图。其中，A: Onc-DT203.柳和One对小鼠骨髓瘤细胞SP2/0的细胞毒性作用比较。 B: Onc-DT203.39o和Onc对人白血病细胞K562的细胞毒性作用比较。 C:Onc-DT2Q3-39o和Onc对人神经母细胞瘤SH-SY5Y的细胞毒性作用比较。 D:Onc-DT2。3.39o和Onc对人急性髓系白血病细胞株HL60的细胞毒性作用比较。具体实施例方式本专利技术人经过长期的研究和试验，首次将核糖核酸酶(Onc)基因和细菌毒蛋 白的膜转位结构本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种融合蛋白，其特征在于，所述的融合蛋白包括： （１）核糖核酸酶； （２）细菌毒蛋白的膜转位结构域； （３）位于（１）和（２）之间的由０－５０个氨基酸构成的连接肽。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：王庆诚，沈如凌，孙瑞林，费俭，李俊，
申请(专利权)人：上海南方模式生物科技发展有限公司，上海南方模式生物研究中心，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]
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