人类白细胞抗原ＨＬＡ－Ｃｗ基因测序分型的方法技术

一种人类白细胞抗原ＨＬＡ－Ｃｗ基因测序分型的方法，它包括ａ、通过两对ＰＣＲ扩增引物对分型目的区域进行ＰＣＲ扩增，其中，第一对扩增引物包含从第１外显子到第４外显子的序列，第二对扩增引物包含从第５外显子到第８外显子的序列；ｂ、通过十二条正向和反向测序引物对扩增产物进行测序反应，其中，分别对ＨＬＡ－Ｃｗ基因的第１、２、３、４、５外显子进行正、反向双向测序，对第６外显子进行正向测序和第７外显子进行反向测序。本发明专利技术基于ＨＬＡ－Ｃｗ基因全长序列和单核苷酸多态性数据而创建，解决了ＡｌｌｅｌｅＳＥＱＲ?ＨＬＡ－Ｃｗ?ｐｌｕｓ试剂盒对人群检测出现的Ｃｗ＊０７０６等位基因漏检以及测序分型中出现的模棱两可的结果问题。该方法适合于中国人群ＨＬＡ－Ｃｗ基因的高分辨水平基因分型，有利于ＨＬＡ－Ｃｗ基因的各种应用和基础研究工作。

Human leukocyte antigen HLA Cw gene sequencing typing method

A method of human leukocyte antigen HLA Cw gene sequence typing, which includes the A, by two pairs of PCR primers for PCR amplification, parting region the first pair of amplification primers contain from exon first to exon fourth sequences, second pairs of primer containing fifth exons from the exon eighth sequence; B, with twelve forward and reverse sequencing primers for sequencing reaction, the amplified products of HLA Cw which were first, second, third, 4, 5 gene exons were positive and reverse sequencing of exon sixth to exon seventh sequencing and reverse sequencing. The present invention is HLA - Cw gene sequence and single nucleotide polymorphism based on data created to solve the AlleleSEQR HLA? Cw? Plus kit for crowd detection of Cw * 0706 allele detection and typing in the problem of ready to accept either course. This method is suitable for the high resolution level genotyping of HLA - Cw gene in Chinese population, which is beneficial to the application and basic research of HLA - Cw gene.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物医学，特别是涉及一种临床移植组织配型的人类白细胞抗原 HLA-Cw基因测序分型的方法。
技术介绍
人类白细胞抗原HLA-Cw基因编码的蛋白为经典的HLA I类分子，不仅递呈内源性 抗原肽给CD8+T细胞识别，介导杀伤性T细胞的免疫应答，而且作为杀伤细胞免疫球蛋白样 受体(Killer Immunoglobulin-likeReceptor, KIR)的配体，调节自然杀伤细胞(Natural Killer cells)的杀伤功能，在移植免疫、肿瘤免疫和抗感染免疫中发挥重要作用。HLA-Cw 分子是由一条具有多态性的α多肽链(45kDa)和一条由位于15号染色体基因编码、没有 多态性的微球蛋白(12kDa)通过非共价键组成的异二聚体。随着HLA-Cw分子的生物学功能、HLA-Cw基因与疾病关联以及HLA-Cw基因与移植 相关性等研究的开展和深入，人们对HLA-Cw基因的传统错误认识被逐渐打破，HLA-Cw分子 倍受研究者关注和重视。编码HLA-Cw分子α链的基因共含有8个外显子，7个内含子。8个外显子分别编 码不同的肽结构域，各外显子及内含子序列长短不一，如表1所示表IHLA-Cw基因各外显子及内含子长度 如表1，第1外显子编码一个短的信号肽(序列长度73bp)，指导α链插入内质网 膜，并在蛋白质翻译后、表达于细胞膜上之前被切除。第2、3、4外显子分别编码α ρ α 2、α 3 结构域，第5外显子编码连接肽、跨膜区和胞浆区尾部的初始部分，第6、7、8外显子编码带 碱性锚定残基的胞浆尾部区。抗原肽结合区顶部有肽结合槽(peptide-binding cleft)，由 α链的^、^两个结构域构成，两端呈封闭状，一般结合8-11个氨基酸残基的肽段，此槽 即为抗原呈递部位。由于第2、第3外显子编码功能比较重要的抗原肽递呈结构域，因此，以 往的HLA-Cw基因的测序分型(Sequence-based typing, SBT)方法主要是对高度多态性的 第2、3外显子进行，但当前普遍还增加了第4外显子多态性的检测即对HLA-Cw基因第2、3、 4外显子进行测序分型，以减少HLA-Cw基因测序分型中出现的模棱两可结果。以聚合酶链反应(PCR)为基础的HLA测序分型(PCR-SBT)方法，被誉为国际HLA 基因分型的金标准。该方法首先对需要分型的外显子区域进行PCR扩增即首先扩增目的基 因片段，然后对纯化的PCR扩增产物进行测序反应、电泳检测和序列分析。目前国内各HLA 分型和临床组织配型工作中的HLA-Cw基因测序分型试剂普遍依赖于进口。但国际上不同 厂家的测序分型试剂盒，扩增HLA-Cw基因目的片段的分子大小和策略有所不同。由于商品 化试剂盒较为昂贵，限制了 HLA-Cw基因测序分型在群体遗传学和骨髓库中的大规模应用。 且现有的商品化试剂盒存在三个问题首先，存在HLA-Cw等位基因的漏检情况。如广泛使用的AlleleSEQRHLA-C plus 测序分型试剂盒，其PCR产物有两条带，一条带从第1外显子延伸至第3内含子，另一条带 从第3内含子至第7内含子，但具体的两对PCR引物序列及其位置尚未公开。申请人曾在 620份汉族健康随机个体中检出了 5例经AlleleSEQR HLA-C plus试剂盒检测结果“异常” 的样本，经分子克隆和单倍体测序，以及自行设计的PCR引物再测序，证实了这5例标本均 存在AlleleSEQR HLA-C测序分型试剂盒用于扩增第1外显子至第3内含子的PCR引物与 Cw*0706等位基因序列不匹配，导致中国人群中Cw*0706等位基因漏检和丢失(见中华医学 遗传学杂志，2009年第5期)。其次，大量新的点突变，被发现分布在第2、3、4外显子以外的第1、5、6、7外显子上 并获得等位基因命名。截至到2009年7月，HLA-Cw所有14个子系中(Cw*01，02，03，04，05， 06，07，08，12，14，15，16，17，18)共有463种等位基因。HLA-Cw基因测序分型时，因第2、3、4 外显子序列一致，将导致测序分型中出现模棱两可结果。在此情况下，可根据不同的等位基 因组合，采用组特异性引物对第2、3、4外显子检测区域进行再测序，或增加其它外显子(如 外显子1、5、6、7)的多态性检测，以解决模棱两可的结果。但HLA-Cw基因外显子1、5、6、7 的测序引物混合液(Reaction Mix)及组特异性引物等，均需购置，非HLA-Cw基因的商品化 常规测序分型试剂盒中所包括，因而增加了实验成本。再次，尽管HLA-Cw位点的等位基因数目增长讯速，但具有全长序列的HLA-Cw等位 基因数目却微乎甚微，特别是缺乏中国人群HLA-Cw等位基因的全长序列和SNPs数据。截止至Ij2009 年 4 月，IMGT/HLA 数据库(http //www. ebi. ac. uk/imgt/hla/)中公 布的HLA-Cw等位基因有440个，其中有全长序列的HLA-Cw等位基因仅49种，大部分的等 位基因缺乏位于其它外显子以及非编码区的SNPs数据和信息，直接影响了高分辨分型的 结果。为此，本申请人建立了 HLA-Cw等位基因全长序列分子克隆及测序方法(中华医学遗 传学杂志.2009，26 :258-262)，测定并获得了中国人群中的35种常见的HLA-Cw等位基因 全长序列，已全部提交国际GenBank数据库和世界卫生组织(WHO)HLA因子命名委员会，均 获得了国际认可(见表2)；从而为基于中国人群HLA-Cw等位基因全长序列中的SNPs信息 设计开发适合中国群体的HLA高分辨分型试剂盒，提供了重要依据。表2中国人群中的35种HLA-Cw等位基因及其全长序列的编号
技术实现思路
本专利技术旨在基于中国人群HLA-Cw基因遗传学基础和全长序列的单核苷酸多态性 (SNPs)资料，创建一种适合于中国人群的，以 解决广泛使用的AlleleSEQR HLA-C plus商品化试剂盒对中国人群检测出现的Cw*0706等 位基因漏检现象，以及解决测序分型中出现的模棱两可的结果问题，可用于HLA-Cw基因的 临床移植组织配型、群体遗传学、人类学及进化学等应用和基础研究。为实现上述目的，本专利技术提供一种， 该方法包括a、首先由两对PCR扩增引物对分型目的区域进行PCR扩增，其中，第一对PCR引物扩增第1外显子到第4外显子的序列，第二对PCR引物扩增第5外显子到第8外显子的序 列；b、通过十二条正向和反向测序引物对扩增产物进行测序反应，其中，分别对 HLA-Cw基因的第1、2、3、4、5外显子进行正、反向双向测序，对第6外显子进行正向测序和第 7外显子进行反向测序。步骤a中，第1至第4外显子的PCR扩增引物包括上游引物C_SBT_F1和下游引物 C-SBT-Rl，其中，上游引物 C-SBT-Fl 的序列为5' -CCA ATC AGCGTC TCC GCA GTC-3 ‘，下 游引物C-SBT-Rl的序列为5' -ACC CCY CAT YCCCCT CCT TAC-3‘；第5至第8外显子的 PCR扩增弓I物包括上游弓I物C-SBT-F2和下游弓|物C-SBT-R2，其中，上游弓|物C-SBT本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种人类白细胞抗原ＨＬＡ－Ｃｗ基因测序分型的方法，其特征在于，该方法包括：　　ａ、首先由两对ＰＣＲ扩增引物对分型目的区域进行ＰＣＲ扩增，其中，第一对ＰＣＲ引物扩增第１外显子到第４外显子的序列，第二对ＰＣＲ引物扩增第５外显子到第８外显子的序列；　　ｂ、通过十二条正向和反向测序引物对扩增产物进行测序反应，其中，分别对ＨＬＡ－Ｃｗ基因的第１、２、３、４、５外显子进行正、反向双向测序，对第６外显子进行正向测序和第７外显子进行反向测序。

【技术特征摘要】
一种人类白细胞抗原HLA Cw基因测序分型的方法，其特征在于，该方法包括a、首先由两对PCR扩增引物对分型目的区域进行PCR扩增，其中，第一对PCR引物扩增第1外显子到第4外显子的序列，第二对PCR引物扩增第5外显子到第8外显子的序列；b、通过十二条正向和反向测序引物对扩增产物进行测序反应，其中，分别对HLA Cw基因的第1、2、3、4、5外显子进行正、反向双向测序，对第6外显子进行正向测序和第7外显子进行反向测序。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(a)中，第1至第4外显子的PCR扩 增引物包括上游引物C-SBT-Fl和下游引物C-SBT-Rl，其中，上游引物C-SBT-Fl的序列为 5' -CCA ATC AGC GTC TCC GCA GTC-3‘，下游引物C-SBT-R1 的序列为5' -ACC CCY CAT YCC CCT CCT TAC-3'；第5至第8外显子的PCR扩增引物包括上游引物C-SBT-F2和下游引 物 C-SBT-R2，其中，上游引物 C-SBT-F2 的序列为5' -TTM TCA GRG AM GCA GAA GTC-3 ‘， 下游引物 C-SBT-R2 的序列为5' -AAT CCT GCA TCT CAG TCC CAC-3‘。3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述第1至第4外显子的PCR扩增引物的 上游引物C-SBT-Fl位于HLA-Cw基因的5’ -启动子区域，下游引物C-SBT-Rl位于HLA-Cw 基因的第4内含子区域，扩增区域涵盖了第2、3、4外显子，还包含了部分5’ -启动子区、第 1外显子、第1内含子、第2内含子、第3内含子以及部分第4内含子序列，并可同时扩增在 引物结合区有单核苷酸多态性的多种等位基因。4.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述第5至第8外显子的PCR扩增引物的上 游引物C-SBT-F2位于HLA-Cw基因的第4内含子区域，下游引物C-SBT-R2位于HLA-Cw基 因的3’-非翻译区，PCR扩增区域涵盖第5、6、7、8外显子，并包括部分第4内含子、第5内 含子、第6内含子、第7内含子及部分3’ UTR区域的序列。5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(b)中，所述测序引物包括第一外显子正向测序引物C1F，其序列为5’ -GTTCTRAAGTCCCCAGTC-3’，第一外显子反 向测序引物 C1R，其序列为5，-GAAATACYTCATGGAGTG-3，；第二外显子正向测序引物C2F，其序列为5' -GGGTCTCAGCCMCTCC...

【专利技术属性】
技术研发人员：邓志辉，徐筠娉，王大明，
申请(专利权)人：深圳市血液中心，
类型：发明
国别省市：94[中国|深圳]