本发明专利技术属生物技术领域，具体涉及一种全长ＦＡＤＤ蛋白质的制备方法。该制备方法利用重组ＤＮＡ技术表达和制备稳定性好、产量高、与野生型ＦＡＤＤ具有完全相同高级结构、具有诱导细胞凋亡活性的全长ＦＡＤＤ蛋白质。其分离纯化过程更加便利、快捷、产率高。本发明专利技术制备的全长ＦＡＤＤ蛋白质能够用于制备诱导细胞凋亡的药物，用于治疗肿瘤和类风湿性关节炎等疾病。本发明专利技术还提供了在原核表达系统表达一种全长ＦＡＤＤ蛋白质的表达方法，能够有效提高该全长ＦＡＤＤ蛋白质的产量。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属基因工程生物
二、
技术介绍
-FADD (Fas-associated death domain protein， Fas相关死亡结构域蛋白) 是Chinnaiyan、 Boldin等两个研究小组利用酵母双杂交系统于1995年同时筛选 得到的一个能够与死亡受体Fas胞浆区特异性作用的蛋白，由于其包含一个与 Fas蛋白质的死亡结构域高度同源的结构域，因而被命名为Fas相关死亡结构域 蛋白(Fas-associated death domain protein, FADD) [Boldin， M. P.等人，1995， J. Biol. Chem. 270:7795-7798; Chinnaiyan, A. M.等人，1995， Cell 81:505-512]。人FADD基因编码208个氨基酸，分子量为23kDa,可分为三个功能区域， 包括与凋亡相关的N端约76个氨基酸的DED (death effect domain,死亡效应 结构域)和C端70个氨基酸的DD (death domain,死亡结构域)，以及在非凋 亡中发挥作用的大约20个氨基酸的C末端片段。作为细胞内的接头蛋白，FADD 能够介导多种死亡受体诱导的细胞凋亡信号通路，包括Fas、 TNFR1、 DR3、 DR4、 DR5和p75NTR等，在多种细胞系中能诱导凋亡的发生，是一个经典的凋亡信号 分子。在死亡受体诱导的细胞凋亡信号通路中，死亡信号(如FasU与死亡受 体(如Fas)结合、导致死亡受体(如Fas)胞内的死亡结构域形成三聚体，从 而通过结合FADD的死亡结构域(DD)招募FADD蛋白质，并引起FADD构象改变， 使其DED多聚化，进而招募胱氨酸蛋白酶8 (caspase8 )前体集聚，形成死亡 诱导信号复合体(death-inducing signaling complex, DISC)，通过产生有活 性的caspase 8，从而激发一系列下游caspase级联反应，诱发细胞凋亡。由 FADD介导的这条凋亡诱导信号通路可以简单地表示为死亡受体 一FADD—caspase-8途径，这也是目前研究最为透彻的一条路径[刘大庆等， 2002，国外医学分子生物学分册，24(5) :260-263]。大量研究表明许多疾病的发生发展(尤其是肿瘤的发生)与细胞凋亡异常 有关。 一般认为肿瘤细胞是因为生长失控而导致的细胞过度增殖；从细胞凋亡的角度看，则认为是肿瘤的凋亡机制受到抑制，肿瘤细胞不能正常发生凋亡并被 清除的结果。FADD作为凋亡信号途径的连接蛋白，在肿瘤的发生发展过程中起着 举足轻重的作用[赵丹，2006,国际免疫学杂志29:152-156; Tourneur， L.等人， 2003， Oncogene 22:2795-2804]。 FADD表达的缺失与肝癌的发生密切相关，FADD 在癌组织中的表达率显著低于癌旁和非癌肝组织，并且其表达水平随肝癌恶性程 度的增加而被下调[Shin,E.C.等人，1998， Cancer Lett. 134:155-162; Sun, B. 等人，2000， Zhong Hua Gan Zang Bing Za Zhi 8:37-39]。 FADD蛋白表达强度 与HCC细胞凋亡密切相关，FADD蛋白表达量越高，其细胞凋亡程度也相对较高[陆 东东等人，2002，临床肝胆病杂志，18:375-376]。在许多肾癌患者体内发现癌 细胞中的FADD表达量明显降低[Xu,H.等人，2009， Cancer Invest,网络版2009 Jun 25:1] 。 FADD表达异常在非小细胞肺癌中也能起到重要作用[Shin, M. S.等人， 2002， Oncogene 21:4129-4136]。针对FADD在细胞凋亡中的衔接和桥梁作用以及其与多种疾病的关系，己有 学者开始尝试利用FADD能够介导细胞凋亡的生物特性来进行疾病的治疗。研究发 现，FADD过表达可促进恶性脑胶质细胞瘤细胞的凋亡。通过瞬时转染FADD基因进 入肿瘤细胞，85%的胶质瘤细胞发生细胞凋亡，而且此过程并不需要上游Fas的参 与[Kondo,S.等人，1998， Human Gene Therapy 9:1599-1608]。利用含FADD基因 的逆转录病毒载体稳定转染肿瘤细胞，在体内和体外都能有效地抑制肿瘤细胞的 存活。另有研究表明FADD基因的表达可以有效地诱导粘液表皮样癌细胞的凋亡 [刘大庆等人，2002， 口腔颌面外科杂志，12:317-320]。此外还发现，FADD的过 表达能增强肿瘤细胞对药物引起的细胞死亡和细胞毒作用的敏感性，达到更好的 治疗目的「Mishima, K.等人，2003， Int. J. Cancer 105:593-600; Micheau，O.等 人，1999， J. Biol. Chem. 274:7987 -7992; Yin，A.等人，Med. Oncol.网络 版2009 May 5]。在此基础上，有研究小组利用人端粒逆转录酶(hTERT)的特性开发了一种 新的基因治疗策略用hTERT基因启动子调控FADD在肿瘤细胞中的特异表达，构 建成hTERT/FADD表达载体，转染入肿瘤细胞内，发现在hTERT表达阳性的肿瘤细 胞中，FADD也呈现阳性表达，并且可有效地诱导肿瘤细胞凋亡的发生，而对hTERT 表达阴性的正常细胞(即不发生FADD高表达的细胞)则无作用[Komata，T.等人，2001， Int. J. Oncol. 19:1015-1020; Koga， S.等人，2001， Anticancer Res. 21:1937-1943]。FADD除了在肿瘤治疗中有重要的应用前景，在其它疾病的治疗上也有较好 的应用前景。类风湿性关节炎是一种非器官特异性自身免疫性疾病。研究表明 Fas介导的细胞凋亡是类风湿关节炎患者关节滑膜细胞退行性变的主要原因之 一，其中FADD—caspase-8的信号传导途径在类风湿关节炎病人的滑膜细胞凋亡 过程中发挥重要作用[Kobayashi，T.等人,1999，Curr. Opin. Rheumatol. 11:188 -193]。利用腺病毒转染将FADD基因转入类风湿关节炎的滑膜细胞后，可引起因 过度增殖导致病变的滑膜细胞的凋亡。另外，在免疫缺陷的类风湿关节炎模型小 鼠中局部注射腺病毒-FADD (Ad-FADD)后可清除病变的滑膜细胞，并且此效果局 限于滑膜组织，而不引起邻近的软骨细胞凋亡。因而FADD过表达可有效地治疗 类风湿关节炎[Kobayashi，T.等人，2000， Gene Therapy 7:527-533]。目前FADD应用于肿瘤和类风湿性关节炎等其它疾病的治疗主要是通过将 FADD基因通过转染试剂或者病毒载体转染进细胞(即基因治疗的方法)，实现 FADD的过表达而达到疾病治疗的目的。作为上述文献中所常规采用的方法，基 因治疗目前主要是通过病毒载体介导的。由于病毒载体存在的种种缺点及基因治 疗在临床实验中表现出的副作用，迄今为止，基因治疗仍然无法在临床得以应用， 尚有待于进一步的完善和改进。既然基因治疗本质上是通过将治疗基本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种全长ＦＡＤＤ蛋白质的制备方法，其特征是利用基因工程技术制备一种第２５位Ｐｈｅ突变成Ｔｙｒ的全长ＦＡＤＤ蛋白质，其Ｎ端或Ｃ端可以分别融合具有帮助蛋白质纯化作用的融合蛋白或短肽标签。
【技术特征摘要】
1.一种全长FADD蛋白质的制备方法，其特征是利用基因工程技术制备一种第25位Phe突变成Tyr的全长FADD蛋白质，其N端或C端可以分别融合具有帮助蛋白质纯化作用的融合蛋白或短肽标签。2. 根据权利要求l所述的一种全长.FADD蛋白质的制备方法，其特征是合成或者克隆该全长FADD基因、构建该全长FADD表达质粒，在常见的基因工程表达体系中进行基因工程表达。3. 根据权利要求1所述的一种全长FADD蛋白质的制备方法，其特征是将该全长FADD蛋白质原核表达菌株在1...
【专利技术属性】
技术研发人员：华子春，陈媛，杜攀，黄启来，
申请(专利权)人：南京大学，
类型：发明
国别省市：84[中国|南京]
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。