本发明专利技术属于生物工程技术领域，公开了一种适用于高ＧＣ含量基因的ＰＣＲ扩增体系及扩增方法，所述ＰＣＲ扩增体系包括：ＤＮＡ聚合酶、ＭｇＣｌ↓［２］、ｄＮＴＰ、上游引物、下游引物、ＤＮＡ模板、二次蒸馏水；其特征在于：所述ＰＣＲ扩增体系还包括：三羟甲基氨基甲烷盐酸盐，二硫苏糖醇，牛血清白蛋白和添加剂。本发明专利技术所述ＰＣＲ扩增技术可扩增ＧＣ含量超过８０％的目的基因；可扩增高ＧＣ含量的目的基因长达１．５Ｋｂ；可以成功地扩增人、动物、植物和微生物等不同来源不同复杂程度的模板基因；并且操作步骤少，操作时间短，所需仪器设备简单，能普遍适用于科学研究和医疗诊断。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物工程
，具体涉及一种适用于髙GC含量基因的PCR 扩增体系及扩增方法。
技术介绍
PCR (Polymerase Chain Reaction)全称聚合酶链式反应，是广泛用于诊断 学、分子生物学、微生物学、遗传学的一项特定DNA体外扩增技术。虽然1988 年以来人们用基本的PCR程序已经成功扩增出了大量的基因片段，但是非特异 性的结果和耗时的过程也开始渐渐无法满足更加广泛的需求。特别是面对具有 特殊二级结构的高GC含量基因，包括一些引物、增强子和其他控制元件，人 们往往束手无策。于是多年来，人们对常规的PCR程序做了很多的改进，也尝 试了很多可以提髙产物特异性的方法，包括热启动、两步PCR、 slowdown PCR 和某些添加剂的应用等。热启动是用95C先使具有复杂二级结构的模板DNA充分变性，再加入Taq 酶，这样做可以避免操作过程中产生非特异性序列的扩增，并将DNA聚合酶与 其他反应物隔绝，避免在未达到设定温度前就开始反应。slowdown PCR是Ulrich H Frey等人于2003年首次报道的，它通过在PCR 的前几个循环使用严谨的退火条件提高特异性。循环设在比估算的Tm髙大约 IOX:的退火温度下开始，然后每三个循环降低1C，直到退火温度低于Tm 5。 这样，特异性最髙的目的片段会被优先扩增，正确和非正确退火温度之间的任 何差异将造成每个循环PCR产物量的两倍差异(每摄氏度造成4倍差异)。因 此，相对于非正确产物，正确的产物可以得到富集，并在随后的循环中继续扩 增占据优势。与此同时，这种程序降低了先前报道的Touchdown PCR扩增过程 中升温降温的速率，变性到退火的降温速率从降低至1.5C/S，同时从退 火到延伸的升温速率从5/s降低至2.5'C/s,使得引物和模板能充分的结合， 同时减少二级结构的形成，从而PCR扩增能顺利进行。近年来，越来越多的可以提髙PCR效率和产物特异性的添加剂被发现，包 括二甲亚砜、甲酰胺、甜菜碱、7-Deaza-dGTP、甘油、聚乙二醇和dUTP等。 在这些添加剂中，虽然7-Deaza-dGTP报道较多，但是其价格昂贵且不易获得。 然而，二甲亚砜、甘油和甜菜碱等添加剂就更为实用。其中，甲亚砜的作用是 减弱模板DNA的二级结构的影响，便于DNA酶延伸，减少非特异性条带，同 时改善GC含量高的DNA的变性情况，使聚合酶更容易在二级结构处延伸，但 是当浓度高(大于10%)时会降低其保真性。同时，二甲亚砜作为有机溶剂， 能破坏DNA聚合酶结合的水化膜，使得DNA聚合酶变性。甘油为多羟基的醇， 可以为DNA聚合酶提供羟基，使DNA聚合酶保持较高的活性保护DNA聚合酶， 从而提高产量，增加酶的稳定性。另外，甜菜碱全名三甲基甘氨酸，它可以通 过与DNA大沟中的AT对结合而影响延伸反应，或者通过与DNA小沟结合， 增加GC对的水化程度，降低双螺旋DNA的稳定，使二级结构易于打开，从而 使得引物能与模板充分结合，保证扩增的顺利进行。虽然上述方法和手段的单独使用都获得了一定的效果，但是对于引物和模 板的要求普遍过于苛刻，适用范围也较为局限，所以在这些基础上的改进显得 极其迫切且具有重大应用价值。
技术实现思路
本专利技术目的是提供一种用于髙GC含量基因的PCR扩增体系。 为达到上述目的，本专利技术具体技术方案是， 一种用于高GC含量基因的高 效PCR扩增体系，所述PCR扩增体系包括DNA聚合酶、MgCl2、 dNTP、上 游引物、下游引物、DNA模板、二次蒸馏水；所述PCR扩增体系还包括三羟 甲基氨基甲烷盐酸盐(THs-HCl, pH7.8) , 二硫苏糖醉，牛血清白蛋白和添加 剂；所述添加剂选自甘油、甘露醇、山梨醇、聚乙二醇、正丙砜、二乙砜、 甲基磺酰甲烷、二甲亚砜、2，4-二甲基噻吩烷、3-环丁烯砜、甜菜碱、1,5，6-三 氢_2_甲基_4-羧基嘧啶、1,6-二氢-2-甲基-4-羧基-5羟基嘧啶、1，4，5,6-四氢-2-甲 基-嘧啶或4，5，6，7-四氢-2-甲基-1氢-l，3-二氮杂卓-4-羧酸中的一种或一种以上的 混合物；其中，每25nL PCR扩增体系包括DNA聚合酶1U 2.5U， MgCl22.5X 10 5mmol 6.25X10 4mmol， dNTP 5 X 10 6mmol 1 X 10 5mmol,上游引物2.5 X10 5nmol 5X10 5fimo1，下游引物2.5 X 10、mol~ 5 X lO^mol, DNA模板 10 100 ng，三羟甲基氨基甲烷盐酸盐lX10-3mmol~1.5Xl(T3mmol， 二硫苏 糖醇 2 X l(r6mmol~3 X l(r6mmol， 牛血清白蛋白 0.5ng 0.7jig，添加剂 0.2fiL 0.3nL。上述技术方案中，所述髙GC含量基因中GC含量髙达85%。 上述技术方案中，所述高GC含量基因选自人类与动物基因组中的原癌基因、疾病相关基因的调控序列、与植物生长、分化相关的调控序列或微生物代谢途径中关键酶等高GC含量基因中的一种。上述技术方案中，所述髙GC含量基因的长度的最大值达1.5Kb。 上述用于髙GC含量基因的高效PCR扩增体系适用范围为所有生物的基因扩增。上述技术方案中，所述DNA聚合酶选自Taq DNA聚合酶、KoD DNA聚 合酶、Pwo DNA聚合酶、pfu DNA聚合酶、Vent DNA聚合酶、Bca Best DNA 聚合酶或SacDNA聚合酶中的一种。上述技术方案中，所述上游引物和下游引物的设计可以采用现有技术，例 如使用任何一种引物设计软件进行设计， 一般为15-30个碱基；或者，优选的 技术方案中，所述上游引物和下游引物的设计采用更为简便快速的简并引物设 计方法，此方法包括(1) 从任何一种基因文库中找到与目的序列具有相似功能的序列，再通过各种 在线或离线软件比对找到与其同源性髙的序列，通过多重序列比对软件进行比 对，建立多重序列比对表。(2) 将多重序列比对表导入保守区分析软件，找到相应的保守区。(3) 根据划分的保守区通过手动或软件分析进行简并引物设计，选择最优简并 引物。上述常规引物和简并引物的GC含量可以较高且引物的解链温度(Tm)值 可达到8Sr并具有引物设计无法避免的发夹结构。上述技术方案中，DNA模板的制备为现有技术，根据模板来源不同，选择不同的模板制备方法，可以用提取的总DNA作为模板。所述DNA模板包括含有丰度低、拷贝数低的目的序列的人和动物全基因组， lOOkb以上的微生物基因组和植物基因组。上述技术方案中，所述添加剂选自甘油、甘露醇、山梨醇、聚乙二醇、 正丙砜、二乙砜、甲基磺酰甲烷(二甲基砜)、二甲亚砜、2，4-二甲基噻吩烷、 3-环丁烯砜、甜菜碱、1，5，6-三氢-2-甲基-4-羧基嘧啶、1，6-二氢-2-甲基-4-羧基-5 羟基嘧啶、l，4，5,6-四氢-2-甲基-嘧啶或4，5，6，7-四氢-2-甲基-1氢-1，3-二氮杂卓-4-羧酸中的两种或两种以上的组合；其中，各化合物的化学通式分别如下所示OHOH '一OH甘油OH聚乙二醇二乙砜甘露醇<formula>formula see original docum本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种用于高ＧＣ含量基因的ＰＣＲ扩增体系，所述ＰＣＲ扩增体系包括：ＤＮＡ聚合酶、ＭｇＣｌ↓［２］、ｄＮＴＰ、上游引物、下游引物、ＤＮＡ模板、二次蒸馏水；其特征在于：所述ＰＣＲ扩增体系还包括：三羟甲基氨基甲烷盐酸盐，二硫苏糖醇，牛血清白蛋白和添加剂； 所述添加剂选自：甘油、甘露醇、山梨醇、聚乙二醇、正丙砜、二乙砜、甲基磺酰甲烷、二甲亚砜、２，４－二甲基噻吩烷、３－环丁烯砜、甜菜碱、１，５，６－三氢－２－甲基－４－羧基嘧啶、１，６－二氢－２－甲基－４－羧基－５羟基嘧啶、１，４，５ ，６－四氢－２－甲基－嘧啶或４，５，６，７－四氢－２－甲基－１氢－１，３－二氮杂卓－４－羧酸中的一种或一种以上的混合物； 其中，每２５μＬ ＰＣＲ扩增体系包括：ＤＮＡ聚合酶１Ｕ～２．５Ｕ，ＭｇＣｌ↓［２］ ２．５×１０↑［－５］ｍｍｏｌ～ ６．２５×１０↑［－４］ｍｍｏｌ，ｄＮＴＰ ５×１０↑［－６］ｍｍｏｌ～１×１０↑［－５］ｍｍｏｌ，上游引物２．５×１０↑［－５］μｍｏｌ～５×１０↑［－５］μｍｏｌ，下游引物２．５×１０↑［－５］μｍｏｌ～５×１０↑［－５］μｍｏｌ，ＤＮＡ模板１０～１００ｎｇ，三羟甲基氨基甲烷盐酸盐１×１０↑［－３］ｍｍｏｌ～１．５×１０↑［－３］ｍｍｏｌ，二硫苏糖醇２×１０↑［－６］ｍｍｏｌ～３×１０↑［－６］ｍｍｏｌ，牛血清白蛋白０．５μｇ～０．７μｇ，添加剂０．２μＬ～０．３μＬ。...
【技术特征摘要】
1.一种用于高GC含量基因的PCR扩增体系，所述PCR扩增体系包括DNA聚合酶、MgCl2、dNTP、上游引物、下游引物、DNA模板、二次蒸馏水；其特征在于所述PCR扩增体系还包括三羟甲基氨基甲烷盐酸盐，二硫苏糖醇，牛血清白蛋白和添加剂；所述添加剂选自甘油、甘露醇、山梨醇、聚乙二醇、正丙砜、二乙砜、甲基磺酰甲烷、二甲亚砜、2，4-二甲基噻吩烷、3-环丁烯砜、甜菜碱、1，5，6-三氢-2-甲基-4-羧基嘧啶、1，6-二氢-2-甲基-4-羧基-5羟基嘧啶、1，4，5，6-四氢-2-甲基-嘧啶或4，5，6，7-四氢-2-甲基-1氢-1，3-二氮杂卓-4-羧酸中的一种或一种以上的混合物；其中，每25μL PCR扩增体系包括DNA聚合酶1U～2.5U，MgCl2 2.5×10-5mmol～6.25×10-4mmol，dNTP 5×10-6mmol～1×10-5mmol，上游引物2.5×10-5μmol～5×10-5μmol，下游引物2.5×10-5μmol～5×10-5μmol，DNA模板10～100ng，三羟甲基氨基甲烷盐酸盐1×10-3mmol～1.5×10-3mmol，二硫苏糖醇2×10-6mmol～3×10-6mmol，牛血清白蛋白0.5μg～0.7μg，添加剂0.2μL～0.3μL。2. 根据权利要求1所述的用于高GC含量基因的高效PCR扩增体系，其 特征在于，所述髙GC含量基因中GC含量髙达85%。3. 根据权利要求1所述的用于高GC含量基因的高效PCR扩增体系，其 特征在于，所述髙GC含量基因选自人类与动物基因组中的原癌基因、疾病 相关基因的调控序列、与植物生长、分化相关的调控序列或微生物代谢途径中 关键酶的基因中的一种。4. 根据权利要求1所述的用于高GC含量基因的高效PCR扩增体系，其 特征在于，所述高GC含量基因的长度的最大值达1.5Kb。5. 根据权利要求1所述的用于高GC含量基因的高效PCR扩增体系，其 特征在于，所述髙效PCR扩增体系适用范围为所有生物的基因扩增。6. 根据权利要求1所述的用于高GC含量基因的高效PCR扩增体系，其 特征在于，所述DNA聚合酶选自Taq DNA聚合酶、KoD DNA聚合酶、Pwo DNA ...
【专利技术属性】
技术研发人员：陈依军，魏茂陈，
申请(专利权)人：陈依军，
类型：发明
国别省市：32[]
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